射干合剂的定性及定量质量控制标准研究

[摘要] 目的 研究完善射干合剂的质量标准。 方法 以氯仿-丁酮-甲醇（3∶1∶1）为展开剂在硅胶G板上定性鉴别射干合剂中射干成分，以氯仿-甲醇（8∶2）为展开剂再硅胶G板上定性鉴别射干合剂中前胡成分，以甲苯-三氯甲烷-丙酮-甲醇（3∶7∶2∶1）为展开剂在硅胶G板上定性鉴别射干合剂中百部成分；建立HPLC法，采用ODS-Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-冰醋酸-水（18∶1.37∶82）为流动相，检测波长266 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，测定射干合剂中射干苷的含量。 结果 射干合剂中均检出了射干、前胡、白前的相应成分，斑点或荧光清晰稳定。此HPLC法稳定可靠，射干合剂中射干苷的平均含量为0.0982 mg/mL。结论 本研究使用的方法条件可以作为射干合剂指控标准的补充，为提高射干合剂质量和疗效提供科学依据。

[关键词] 射干合剂；质量控制；定性；定量

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）04（c）-0020-0

[Abstract] Objective To explore new methods for improving the quality standards of Shegan Mixture. Methods Shegan was qualitatively identified by TLC using Chloroform-Butanone-Methanol （3∶1∶1） as developing solvent on silica gel G plate， Qianhu was qualitatively identified by TLC using Chloroform-Methanol （8∶2） as developing solvent on silica gel G plate， Baibu was qualitatively identified by TLC using Methylbenzene-Trichloromethane-Acetone-Methanol （3∶7∶2∶1） as developing solvent on silica gel G plate. Tectoridin in Shegan Mixture was quantified by HPLC with ODS-Ⅱ column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， flow velocity was 1.0 mL/min. The moving phase was Acetonitrile-Glacial acetic acid-Water （18∶1.37∶82） and determining wave length was 266 nm. Results Shegan， Qianhu and Baibu were identified in Shegan Mixture. Fluorescent spots were clear and stable. HPLC method was stable and reliable. The Tectoridin’s content in Shegan Mixture was 0.0982 mg/mL. Conclusion Those methods in this study can be used as addition of quality control standard of Shegan Mixture， which provide scientific basis to improve quality and efficacy of Shegan Mixture.

[Key words] Shegan mixture； Quality control； Qualitative analysis； Quantitative analysis

射干合剂是新华医院的院内制剂，是著名儿科名家时毓民的经验方，由炙麻黄、射干、黄芩、前胡、杏仁、僵蚕、G菜、蝉蜕、炙百部组成，具有宣肺祛痰止咳、降气平喘的功效。常用于感冒、急性支气管炎及哮喘性支气管炎引起的咳喘、多痰等症状。多年临床应用，临床疗效确切[1]。目前其质量标准只采用TLC法鉴别了黄芩和麻黄两味药材，没有含量测定项目，质量标准控制标准有待提高。本研究旨在报道其制备工艺，并通过研究相关成分的薄层色谱和高效液相色谱的色谱条件，进一步完善其质量控制要求。

1 仪器及试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Agilent LC1200，美国安捷伦科技有限公司）；电子分析天平（Mettler-Toledo XS，德国梅特勒公司）；明澈TM-D24UV纯水系统（Merck Millipore）；超声波清洗器（UP600YHE，南京垒君达超声电子设备有限公司）。

1.2 试药

射干合剂（本品，新华医院中药房，批号：20141224）；射干、前胡、百部对照药材（新华医院中药房）；射干苷（中国药品生物制品检定所，110715-200815，含量95.2%）；射干合剂（上海静安制药有限公司，141224）；甲醇（上海振兴化工厂一厂，AR，201309201）；乙醇（AR）；氯仿（AR）；三氯甲烷（江苏强盛功能化学股份有限公司，AR，20110901）；丁酮、丙酮（南京化学试剂有限公司，AR，080410235）；三氯化铝（江苏强盛功能化学股份有限公司，AR，20101011）；甲苯（上海振兴化工厂一厂，AR，201111202）；水为自制高纯水。

2 方法与结果

2.1 处方及其制备

以1000 mL量射干合剂制备工艺报道如下：

2.1.1 处方

炙麻黄75 g、射干75 g、黄芩200 g、前胡150 g、杏仁75 g、僵蚕150 g、G菜300 g、蝉蜕75 g、炙百部150 g、蔗糖100 g、甜菊素5 g和苯甲酸1 g。

2.1.2 制备工艺

麻黄加水浸泡1 h，煎煮两次，每次加10倍量水，第一次0.5 h，第二次1.5 h，合并煎液，滤过，浓缩至相对密度1.16，浓缩液备用。麻黄药渣与其余8味煎煮两次，第一次加10倍量水，煎煮1.5 h，第二次加8倍量水，煎煮40 min，合并煎液，过滤，浓缩滤液至相对密度1.08～1.10（80～85℃）。加2倍量乙醇搅匀沉降24 h，取上清，回收乙醇，减压浓缩至相对密度约为1.16（80～85℃）。加麻黄浓缩液共煮沸10 min，静置24 h，取上清过滤备用。取蔗糖加水煮沸制成糖液，加入甜菊素5 g和苯甲酸1 g，与上述药液合并，加水至总量1000 mL，搅拌均匀，过滤即得。

2.2 射干、前胡和百部的薄层板鉴别

2.2.1 射干的TLC鉴别

2.2.1.1 供试液的制备 取本品60 mL蒸干，加甲醇20 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解作为供试液。

2.2.1.2 对照液的制备 取射干对照药材5 g，加水50 mL煮沸30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇20 mL，同法制得对照液。

2.2.1.3 TLC操作 参照薄层色谱法[2]（《中国药典》2015年版一部附录Ⅵ B）。毛细定量管分别吸取供试液和对照液各2 μL条状上样，供试液从左向右上样5次，对照液右侧上样1次。薄层板选用硅胶G板，展开剂为氯仿-丁酮-甲醇（3∶1∶1）。展开箱中预饱和30 min，上行展开8 cm。取出晾干，喷三氯化铝，置紫外灯（365 nm）下检视、拍照。本实验下射干供试液在紫外灯下TLC谱图中在与各自对照液谱图相应的位置上显相同的荧光斑点。见图1（封三）。

2.2.2 前胡的TLC鉴别

2.2.2.1 供试液的制备 取本品35 mL蒸干，加乙醇10 mL，超声处理15 min，过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解作为供试液。

2.2.2.2 对照液的制备 取前胡对照药材2 g，加水50 mL煮沸30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇10 mL，同法制得对照液。

2.2.2.3 TLC操作 参照薄层色谱法[2]（《中国药典》2015年版一部附录Ⅵ B）。毛细定量管分别吸取供试液和对照液各5 μL点样，供试液从左向右上样5次，对照液右侧上样1次。薄层板选用硅胶G板，展开剂为氯仿-甲醇（8∶2）。展开箱中预饱和15 min，上行展开8 cm，置紫外灯（365 nm）下检视、拍照[3-4]。本实验下前胡供试液在紫外灯下TLC谱图中在与各自对照液谱图相应的位置上显相同的荧光斑点。见图2（封三）。

2.2.3 百部的TLC鉴别

2.2.3.1 供试液的制备 取本品20 mL蒸干，加80%乙醇30 mL加热回流1 h，过滤，滤液挥干乙醇，残留液加1%盐酸10 mL稀释，过滤，滤液用三氯甲烷提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，即得供试液[5]。

2.2.3.2 对照液的制备 取百部对照药材2 g，加水50 mL煮沸30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加80%乙醇30 mL，同法制得对照液。

2.2.3.3 TLC操作 参照薄层色谱法[6]（《中国药典》2015年版一部附录Ⅵ B）。毛细定量管分别吸取供试液和对照液各6 μL点样，供试液从左向右上样5次，对照液右侧上样1次。薄层板选用硅胶G板，展开剂为甲苯-三氯甲烷-丙酮-甲醇（3∶7∶2∶1）。展开箱中预饱和30 min，上行展开8 cm。晾干喷改良碘化铋钾试液显色，日光下检视，拍照。百部供试液日光下TLC谱图中在与各自对照液谱图相应的位置上显相同颜色的斑点。薄层色谱图见图3（封三）。

2.3 射干合剂中射干苷的HPLC测定

2.3.1 色谱条件

ODS-Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-冰醋酸-水（18∶1.37∶82）；检测波长：266 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL，室温[7-8]。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称量射干苷的对照品0.1 mg，用甲醇制成0.1 mg/mL的对照品母液，再用甲醇稀释为0.01 mg/mL的对照品溶液。

2.3.3 供试品的制备

精密量取射干合剂1 mL，甲醇定容至10 mL，超声，离心，取上清液备用。

2.3.4 检测波长的确定

用紫外分光光度计将射干苷对照品溶液在200～400 nm波长范围内扫描，结果表明其在274 nm波长处有最大紫外吸收，故选择274 nm作为射干苷的检测波长。

2.3.5 系统适应性实验

按“2.3.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL进样测定，记录色谱图。HPLC色谱图见图4～5。

2.3.6 线性关系考察

精密吸取对照品溶液（0.023 mg/mL）2、4、8、l6、24 μL按“2.3.1”项下色谱条件进样，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线图，计算得回归方程：Y=4349.7X+23.662，r = 0.999。表明射干苷在0.0208～0.2496 μg范围内具有良好的线性关系。

2.3.7 空白干扰试验

取除射干外处方中中药饮片，按处方制备成阴性对照糖浆剂，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，阴性对照色谱图中在射干苷的保留时间位置上无峰出现，表明阴性对照溶液在本色谱条件下无干扰。射干合剂射干阴性对照品HPLC色谱图见图6。

2.3.8 精密度试验

精密吸取射干合剂对照品溶液（0.0104 mg/mL），重复进样5次，进样量10 μL，计算射干苷峰面积的相对标准偏差（RSD）=1.10%（n=5），表明精密度良好。

2.3.9 稳定性试验

精密吸取对照品溶液20 μL，于制备后0、2、4、6、8、12 h分别进样测定。计算射干苷峰面积RSD=1.1%，表明供试品稳定性良好。

2.3.10 重现性试验

精密量取射干合剂1 mL（批号：141224），共6份，制备供试品溶液，在本色谱条件下进样测定，测得样品中射干苷含量为0.0985 mg/mL，RSD=0.88%，表明方法重现性良好。

2.3.11 加样回收率试验

精密称取已知射干苷含量的射干合剂1 mL（批号：141224），精密加入不同量的射干苷对照品，制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算射干苷的含量。

2.3.12 样品含量测定

精密吸取供试品溶液各20 μL，按本色谱条件测定射干苷含量，结果表明射干合剂中射干苷平均含量为0.0982 mg/mL。

3 讨论

射干合剂是新华医院院内制剂，化裁于《金匮要略》中射干麻黄汤，组方包括射干、麻黄、前胡、黄芩、杏仁、江剪刀草、百部等中药。治疗感冒咳嗽、急性支气管炎及哮喘性支气管炎疗效确切。但目前其质控标准中仅关注麻黄和黄芩两味药物的定性或定量研究[9]。射干麻黄汤中，麻黄与射干共同作为君药[10]，射干功善清热化痰，可治痰热壅肺，与麻黄、黄芩合用，有止咳化痰平喘之功效，临床应用效果良好。前胡降气化痰，白前润肺下气止咳，对于新咳久咳均有疗效[11]，因此对射干、前胡、白前三药严格的质量控制是射干合剂发挥良好临床疗效的重要保障。

本研究采用薄层色谱法对射干合剂中射干、前胡、白前的成分与各生药饮片进行了初步鉴别对比，结果显示本试验中的薄层色谱条件下射干合剂中均检出了射干、前胡、白前的相应成分，本试验条件可以作为射干合剂中射干、前胡、白前定性鉴别的质量控制方法。

射干是常用中药，其生药是鸢尾科植物射干，主要产自于湖北、河南、江苏、安徽等地，近几版《中国药典》均有收载。射干味苦性寒，入肝、肺经。具有清热解毒、利咽、消痰之功效[12]。主治咽喉肿痛、痰盛咳喘的方剂中多以射干为君药，有很好的疗效。现代研究发现射干含有丰富的异黄酮类化合物[13-14]，具有明显的抗炎、抗病毒作用。其主要成分在体外也有抗透明质酸酶的作用[15]，对透明质酸酶所致大鼠足浮肿有明显抑制作用。射干苷为其主要成分之一， 可用作射干合剂的质量控制指标。

射干苷又名鸢尾苷[16]，具有一定的抗炎、抗氧化[17]、抑菌[18-19]、抗病毒[20]的作用，对本研究还采用HPLC法测定了射干合剂中射干苷的含量，初步建立起了测定射干合剂中射干苷的HPLC方法和条件，方法学实验表明本方法和条件稳定可靠，可以作为射干合剂中测定射干苷的质量标准。

综上所述，本研究方法可以作为射干合剂质控标准的补充，对于保障射干合剂质量安全和疗效具有意义。

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（收稿日期：2016-01-22 本文编辑：赵鲁枫）