雷公藤内酯醇对AA大鼠脊髓和背根神经节中iNOS,SP表达的影响

[摘要] 目的：观察不同剂量雷公藤内酯醇（triptolide，TP）对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠的镇痛效应，及相应节段脊髓背角和背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、P物质（substance P，SP）表达的影响，探讨TP对类风湿性关节炎（RA）镇痛作用的可能机制。方法：选用SD大鼠50只，随机分成正常组（A组）、模型组（B组）、TP低（C组）、中（D组）、高（E组）剂量治疗组。除A组外，每组大鼠右后足跖皮内注入0.1 mL弗氏完全佐剂造模。造模后14 d，C，D，E组大鼠采取不同剂量（C组0.1 mg・kg-1，D组0.2 mg・kg-1，E组0.4 mg・kg-1）TP腹腔注射给药，每天1次，连续给药9 d之后检测50%机械痛阈（mechanical withdraw threshold， MWT），用免疫组织化学方法检测腰5（L5）脊髓背角和DRG节段中iNOS，SP的表达变化情况。结果：B组大鼠50%MWT显著低于A组（P

[关键词]佐剂性关节炎；雷公藤内酯醇；镇痛；诱导型一氧化氮合酶；P物质

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者疼痛明显，镇痛治疗是治疗RA的首要环节，也是判定该病疗效的重要标准[1]。雷公藤制剂在临床上治疗RA具有确切的镇痛疗效，但其镇痛的中枢神经生物学机制尚未明确。已有资料表明[2-3]，关节疼痛的发生与脊髓iNOS，SP的增加有关，抑制脊髓iNOS，SP的表达可以产生明显镇痛作用。而作为雷公藤制剂中药理活性最强的雷公藤内酯醇（triptolide，TP）对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠镇痛作用及其与脊髓iNOS，SP表达的关系研究尚未见报道。本实验在建立AA大鼠模型基础上，通过应用不同剂量TP治疗AA大鼠，以机械痛阈、腰5（L5）节段脊髓和背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）中iNOS，SP表达水平为观察指标，旨在探讨TP对AA脊髓和背根神经节（DRG）中iNOS，SP表达影响及其镇痛作用的机制。

1材料与方法

1.1动物和药品 SD大鼠50只，雌雄各半，体重180～220 g，由宁波大学实验动物中心提供，合格证号0102013。饲养环境安静，室温20 ℃左右，明暗各12 h，自由摄食，饮水。TP购于上海科卫医疗技术研究所产品（纯度99.9%，批号20130111），将20 mg TP于4 mL 1，2-丙二醇中99 ℃水浴6 h溶解，加96 mL生理盐水使TP终浓度为200 mg・L-1，同时制备4%丙二醇水溶液100 mL，过滤除菌分装，4 ℃冰箱保存备用。

1.2试剂与仪器 弗氏完全佐剂（美国Sigma公司）；戊巴比妥钠（德国Merck公司）；兔抗iNOS，SP多克隆抗体原液（博士德公司）；DAB显色试剂盒（博士德公司）；SP免疫组化染色试剂盒（博奥森公司）。Ne12775-9von Frey丝（美国Stoelting公司）；HM-325石蜡切片机（德国LEICA公司）；BM-Ⅶ包埋机（宏业医用仪器公司）；CX40生物显微镜（日本Olympus公司）。

1.3动物分组及AA大鼠模型制备 适应性喂养1周后，采用简单随机的方法将SD大鼠分成正常组（A组）、模型组（B组）、TP低剂量治疗组（C组）、中剂量治疗组（D组）、高剂量治疗组（E组）。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，A组于右后足跖皮内注入0.1 mL生理盐水作为对照，其余各组大鼠在相同部位注入0.1 mL弗氏完全佐剂制备AA大鼠模型，待继发关节炎出现，标志造模成功，大约需要10～14 d。造模后第14天，A组和B组大鼠腹腔注射等体积4%丙二醇溶液，C，D，E组大鼠分别按0.1，0.2，0.4 mg・kg-1腹腔注射TP溶液，每日1次，连续9 d。

1.450%机械痛阈测定 测定50%机械痛阈（mechanical withdraw threshold，MWT）采用8根von Frey丝，分别为0.4，0.6，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，15.0 g。于造模前1 d，造模后14，23 d（TP治疗9 d）将大鼠置于透明有机玻璃箱中，底部为金属筛网。参照文献使用的方法[4]，从2.0 g开始用von Frey丝垂直刺大鼠足底，直至其弯曲成S形，持续时间不超过8 s。若大鼠出现缩足反射，记为阳性反应，以“x”表示，并更换相邻小一级von Frey丝再次测试；若无缩足发射，记为阴性反应，以“o”表示，并更换相邻大一级von Frey丝再次测试，测试间隔时间10 s。如此可得到一个连续的以“o”或“x”组合的序列，以出现“x”的前一次的“o”作为起点，选择包括该起点的6次连续刺激反应，作为推算50%MWT的序列。如果大鼠对2.0～15.0 g的刺激均为阴性时记为15 g，对2.0～0.4 g的刺激均为阳性时记为0.4 g。非上述2种情况50%MWT则根据下列公式推算：50%MWT（g）=（10[xf+Kδ]）/10 000，其中xf为序列中最后一根von Frey丝的对数值；K为根据测量所得“x”和“o”序列查表后得到的值；δ为各个纤毛力度取log后的均差，在此约等于0.224。

1.5免疫组织化学染色观察各组大鼠脊髓和DRG中iNOS和SP的表达 造模后23 d，先测定各组大鼠的50%MWT，然后大鼠经左心室灌流固定，先以生理盐水快速冲洗，直至由右心耳流出的液体清亮无色，然后用4 ℃预冷的4%多聚甲醛先快后慢灌流固定，灌注完毕后取L5节段脊髓和DRG，入固定液固定24 h后，L5节段脊髓和DRG经脱水，石蜡包埋、切片，按照试剂盒说明书进行iNOS，SP免疫组织化学染色。每只动物随机选取脊髓和DRG切片各3张，分别在100，400倍镜下取6个视野进行图像分析（JD801形态学图像分析系统），测量阳性产物的积分吸光度（IA）。

1.6统计学分析 结果用±s表示，采用SPSS 13.0软件进行重复测量资料的单因素方差分析。以P

2结果

2.1不同剂量TP对AA大鼠50%MWT的影响 造模前各组大鼠50%MWT无显著差异。B，C，D，E组大鼠被注射弗氏完全佐剂14 d后，造模成功，B，C，D，E组大鼠50%MWT均显著低于A组（P

2.2不同剂量TP对各组大鼠L5脊髓背角和DRG中iNOS含量变化影响 治疗9 d时，L5DRG和脊髓背角中iNOS免疫组化表达情况表明，B组IA显著高于A组（P

2.3不同剂量TP对各组大鼠L5脊髓背角和DRG中SP含量变化影响 治疗9 d，L5DRG和脊髓背角中，B组SP免疫阳性细胞的IA均显著高于A组（P

3讨论

研究发现[5]，关节炎持续性疼痛产生的原因可能与中枢敏化现象相关，患者处于免疫功能异常等病理状态时，脊髓的胶质细胞就会被激活，释放出多种致痛物质，例如iNOS，SP，一方面作用于痛觉神经元，使其兴奋性增强，向高级中枢传递疼痛信号，另一方面降低神经元的兴奋阈值，造成中枢敏化，使很多正常时不能引起疼痛的低强度刺激也能激活伤害性感受器。同时，这些细胞因子还可以作用于胶质细胞产生正反馈作用，进一步增加细胞因子的数量，造成持续性疼痛。

痛阈是目前被广泛采用以判断镇痛效果的指标。本实验观察到，造模前各组大鼠50%MWT无显著差异，造模后14 d，除A组外各组大鼠50%MWT显著降低，说明AA大鼠发生痛觉超敏。治疗9 d，C，D，E组大鼠50%MWT即显著高于B组，说明TP已经发挥了镇痛作用。这表明低、中、高剂量TP均起到了良好的镇痛作用，尤其以中、高剂量组效果显著。

一氧化氮（nitric oxide，NO）参与人体的许多生理过程，是调节疼痛的重要介质，它在痛觉过敏的形成和发展过程中扮演了一个复杂和多样化的角色。研究表明，伤害性刺激引起脊髓背角神经元释放NO，NO与多种递质相互作用，加强疼痛信号在脊髓后角的调制，产生病理性疼痛[6]。iNOS是一种生成NO的限速酶，Aley等[7]证实，iNOS的抑制剂甲基精氨酸可以阻止强致痛物质PGE2（prostaglandin

E2）引起的痛觉过敏，并可使已经发生的痛觉过敏逆转。SP是伤害性传入末梢释放的一种兴奋性递质，它与疼痛关系密切。SP不仅广泛分布于中枢、外周神经系统，而且在各种组织中呈现出多种生物效应，最为重要的是它能够在脊髓水平参与痛觉的调控。SP在DRG中合成后，通过轴浆运输系统同

时向初级传入中枢和外周运输。周围神经中SP 主要由DRG细胞合成，然后沿着背根传入纤维转运至位于背角最背部第1和第2层的末梢以及周围神经纤维和游离神经末梢[8]。Wajima Z等[9]的研究表明，鞘内应用SP，会因由G蛋白结合NK1受体激活而产生热痛觉过敏，说明SP是伤害性传入末梢释放的一种兴奋性递质，它在脊髓参与伤害性信息传递，产生致痛作用。可见SP及iNOS在脊髓痛觉调制中起着重要的作用。

本实验观察到治疗9 d时，B组大鼠脊髓背角和L5DRG中iNOS和SP阳性产物表达显著高于A组，结果提示iNOS，SP参与了AA的关节痛发作，与文献报道一致[10-11]，在AA形成后，来自外周伤害性信息传入增加，导致DRG神经元和脊髓内SP，iNOS进一步增多加重疼痛的发生，提示iNOS和SP参与了AA大鼠痛觉超敏的发生。

本研究结果显示，经TP治疗后，C，D，E组大鼠iNOS和SP阳性产物表达均有所下降，显著低于B组，同时呈现一定的量效关系。分析这一结果产生的可能原因为：在关节炎形成后，TP使伤害性刺激信息传入减少，因而脊髓背角和L5DRG中SP，iNOS的合成也相应减少。雷公藤对iNOS和SP的表达影响已有文献报道，例如，Kim Y H等[12]的研究证实TP可抑制RAW 264.7小鼠巨噬细胞iNOS的表达，冯红德等[13]的研究也表明，经雷公藤多苷干预后，AA大鼠，血浆，滑膜中SP含量均明显下降。综上所述，本研究的结果提示TP对RA的镇痛作用与其下调脊髓背角和L5DRG中iNOS和SP阳性产物表达有关，其具体的生物学机制有待进一步研究加以明确。

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Effect of triptolide on iNOS and SP expressions in spinal dorsal horn and

dorsal root ganglion of rats with adjuvant arthritis

CHEN Wei， ZHANG Xu-dong， LU Zhuo-hui， WEI Deng-ming*

（Department of Pathology， School of Medicine， Ningbo University， Ningbo 315211， China）

[Abstract] Objective： To observe the analgesic effect of triptolide （TP） of high， middle and low doses on rats with adjuvant arthritis （AA）， and the expressions of inducible nitric oxide synthase （iNOS） and substance P（SP） in spinal dorsal horn and dorsal root ganglion（DRG） of corresponding sections， in order to discuss the possible mechanism for the analgesic effect of TP on rats with adjuvant arthritis. Method： Fifty SD rats were selected and randomly divided into the normal group（group A）， the model group（group B）， and TP low（group C）， middle（group D）， high（group E） dose groups. Except for the group A， all of the remaining groups were injected with 0.1 mL of freund′s complete adjuvant through their right rear toes to establish the model. At 14 d after the model establishment， rats in C， D and E groups were intraperitoneally injected with different doses of TP （0.1 mg・kg-1 for the group C， 0.2 mg・kg-1 for the group D， 0.4 mg・kg-1 for the group E） once a day for 9 days. Then the 50% mechanical withdraw threshold （MWT） was determined. And the expressions of iNOS and SP in lumbar5 （L5） spinal dorsal horn and DRG were detected with the immunohistochemical method. Result： The 50% MWT of rats in the group B was significantly lower than that of the group A（P

[Key words] adjuvant arthritis； triptolide； analgesia； inducible nitric oxide synthase； substance P

doi：10.4268/cjcmm20140926