银杏平颤方及其拆方对PD小鼠行为学形态学的影响

摘 要：目的：探讨中药治疗帕金森病(PD)的作用和机制，观察银杏平颤方及其拆方对帕金森病(PD)模型小鼠行为学和形态学的影响。方法：应用MPTP制作PD小鼠模型。应用爬竿试验测试行为学变化和HE染色观察黑质和纹状体形态结构的变化。结果：(1)模型组行为学评分明显高于正常组(P

关键词：银杏平颤方；MPTP；形态学；行为学；帕金森病；中药

中图分类号：R285.5

文献标识码：A文章编号：

1673-7717（2008）11-2348-04

Experimental Study on Treatment of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe

and Its Diffrent Combination on the Behavioral Test and Morphology in the Model

Mouse with Parkinson Disease

ZHANG Jun1,LI Qianjun1,SHUN Hongmei1,BAI Limin1,QIU Tingjian3

（1.Guangzhou University of Chinese Medicie,Guangzhou 510120,Guangdong,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3.Hulin Hospital of TCM,Hulin 158400,Heilongjiang,China）

Abstract：Objective：To investigate the effect and its mechanism of Chinese herb recipe in the treatment of PD，to measure the effect of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe and its three similar prescriptions on the behavioral test and neurons in substantia nigra compacta（SNc）and striatum of model mouse for PD．Methods：The Parkinson’s disease model was established by consecutive administration of MPTP to C57／BL mice． The doses of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe were respectively given for 2 weeks and 4 weeks in the treatment groups. Animals were examined behaviorally with the pole test consecutively. then killed，Taking out the forebrain and striate body were observed in morphology by HE.Results：(1)Ginkgo Biloba Pingchan Recipe(GBPR) and its three similar prescriptions improved the dyskinesia of PD mice and showed different disability in pole the test and decrease of spontaneous motor activity, the model group mice demonstrated dyskinesia, scores obtained from the behavioral test were increased significantly compared with Normal control group. While the scores in treatment groups showed a marked decrease to some degree (allP0.05).(2)GBPR and its three similar prescriptions protected neurons in SNc. The HE showed that, there were seldom neurons in SNc in model group;while there were much more neurons presented in the treatment groups than that in model group.Conclusion：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe plays role in improving disability in pole test and increased spontaneous motor activity and in protection the neurons．

Keywords：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe;MPTP;behavioral test;morphology;Parkinson’s disease；Chinese medicine

帕金森病又称震颤麻痹，是一种好发于中老年人[1]的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，现在多数学者认为与氧化应激－自由基有关[2-3]。原发性帕金森病的主要临床症状和体征为静止性震颤、肌强直、少动和障碍。有时可出现面目呆滞、发音低、书写字体过小、唾液增多、皮脂外溢、体温增高、出汗增多、便秘、疲乏、手脚痉挛引起的疼痛、抑郁及情感方面改变等。延缓PD功能障碍的抗氧化治疗有诱发精神障碍的副作用[4-5]。为了研究探讨PD的发病因病机，建立了不同的动物模型。以往的研究已证实MPTP小鼠模型的生物化学和组织化学特征均与临床PD相似。因此，本实验采用以MPTP腹腔注射诱发PD小鼠模型，观察PD小鼠行为学、病理学的变化，研究中药银杏平颤方及其拆方对PD小鼠行为及DA能神经元形态结构的影响，以探讨其防治PD的机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物C57/BL6J小鼠，雄性，6～7周龄，体重（18±2）g，购于北京维通利华公司实验动物中心。动物自由进食饮水，动物房12h光、暗交替，平均温度22℃，相对湿度30%。

1.1.2主要仪器1510石蜡切片机：德国LETIZ公司。H-160万能研究显微镜：美国POLYVAR公司。Olympus BX5显微镜：日本Olympus株式会社。Image-pro Plus 5.0图象分析系统:日本Olympus株式会社。自制小鼠测试杆。

1.1.3化学试剂MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine）购于美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1中药制备乙醇提取法获得浸膏,溶于蒸馏水中，根据药理学方法计算小鼠给药量[6]，动物用药量根据成人6倍量计算，按照每次灌胃量0.5mL配制。0.1mPa灭菌15min，4℃保存备用。每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃。

1.2.2小鼠PD模型的建立参照Nobutaka Arai,Kazuaki Misugi的实验方法[7]，略加修改，小鼠造模前采用爬杆法[8]进行筛选：动物给药前，先引导动物在15s内由杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕对其进行测定，选用0分C57-BL/6J小鼠（评分标准见表1），用生理盐水配制的0.3%MPTP（按30mg•kg-1•d-1）腹腔注射，连续5天。

1.2.3动物分组及处理选取0分小鼠随机分成6组,每组12只: ①正常对照组(简称正常组，Normal control，NC)：不作任何处理。②模型对照组(简称模型组，Model control，MC)：生理盐水每天灌胃0.5mL/只。③银杏平颤方全方治疗组(简称全方组,Ginkgo Biloba Pingchan Recipe,G)：灌胃全方中药每天约0.5mL/只(含生药量1.18g/mL)。④清热解毒方治疗组(简称解毒组,Jiedu Recipe,J)：解毒中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。⑤平肝熄风方治疗组(简称平肝组,Pinggan Recipe,P):平肝熄风中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。⑥化瘀通络方治疗组（简称化瘀组,Huayu Recipe,H）:化瘀通络中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。第②～⑥各组从造模第1天开始灌胃，每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃，各治疗组给予相应中药灌胃，模型组给予生理盐水灌胃。MPTP用生理盐水配制，每日30mg/kg腹腔注射，1日1次，各组连续用药5天。以上各组每日进行2次爬杆试验并进行评分，结果进行统计学处理。动物的存活期分别是造模开始14天和28天。

1.2.4小鼠行为学测试爬杆实验：所用工具为一直径13mm、高760mm的光滑不锈钢杆，垂直竖立，将小鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为，并按标准计分，评分标准见表1。实验前每只小鼠爬杆2次，选用爬杆行为计分为0分的动物用于实验，称重并随机分组。所有动物于注射MPTP前及末次注射后第1至第3周每日口服药物前后，均进行爬杆试验，每只鼠爬杆2次，积分并计算平均分，评分结果进行统计学分析。

1.2.5组织形态学观察①取材及材料处理：动物用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，打开胸腔，先经左心室升主动脉快速推注生理盐水20mL，后缓缓推注10%福尔马林灌流固定，取脑、置于10%福尔马林固定1周。脑组织经常规步骤处理：脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切片、片厚6μm，常温保存备用。

②HE染色法：石蜡切片烤干，脱蜡，脱苯，Ehrlich氏苏木精染，盐酸酒精分化，蓝化，伊红染色，脱水，透明、中性树脂封片。

③光镜下观察并摄片：根据小鼠脑立体定位图谱，每组每只动物选一张脚间核平面切片，取材部位见图1。

2结果

2.1小鼠行为学改变

2.1.1注射MPTP后 各组小鼠行为表现各组给药（MPTP）后10min小鼠都出现不同程度的肢体震颤，开始前肢抬举伴震颤，后肢僵硬，竖尾、竖毛及跳、蹿等动作，持续约30min后，又出现运动障碍，动作迟缓，短暂性活动减少，对外界刺激易产生尖叫，逃避反应慢；注射MPTP后1h，小鼠表现明显的运动减少，对外界刺激反应低下，之后逐渐恢复。但各组动物症状都于24h后完全消失。随着用药时间延长，动物运动障碍程度增加，症状持续时间和恢复时间延长。中药全方组和拆方各组均可不同程度改善PD小鼠出现的爬杆能力下降、时间延长和自发活动次数减少等上述小鼠行为学异常与模型组比较有显著性差异（P均

2.1.2中药银杏平颤方及其拆方对PD小鼠爬杆行为的影响正常组小鼠在给予生理盐水前后，爬杆测试无明显差异。MPTP 30mg•kg-1•d-1腹腔注射后当日及以后几天，协调能力明显降低，表现为快速下滑，甚至不能抱杆、坠落，持续4日后，于第5日末次注射MPTP后小鼠协调能力逐渐恢复，模型对照组1～4周评分结果与正常对照组相比升高且均有显著性差异（P

2.2病理学改变

2.2.1肉眼观察全部小鼠脑标本外观均未见明显异常，切面检查亦未见出血、坏死和软化灶。

2.2.2HE染色光镜观察正常组14天、28天脑黑质神经细胞形态正常，体积正常，结构清晰，密集成群。模型组14天、28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显减少，部分神经元丧失，残留神经元呈大多角形或锥体形状，有的胞体变小，胞核固缩，胞核结构不清，有的胞核变大，核染色质疏松，有颗粒出现，核周围胞浆有溶解样改变；胞浆染色加深，胞浆内可见大小不等的嗜酸性颗粒并出现小空泡。大部分小鼠黑质区域内尚可见广泛的淋巴细胞浸润，部分淋巴细胞围绕在血管周围形成血管套。残存的神经元体积瘦小，结构不清晰，色素变浅，同时伴轻度胶质细胞增生；与模型组14天和28天比较，银杏平颤方全方及拆方各组14天和28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显增多，神经元体积较饱满，结构较清晰；各中药治疗组14天黑质区神经元形态与28天各组相比基本相似，黑质区神经元数量未见明显减少，但有少数神经元变性，细胞呈圆形或卵圆形，胞浆内未见嗜酸性颗粒出现。但总的看来中药各治疗组与正常对照组比较神经细胞未见明显减少，无特异性改变；有的可见星形细胞轻度增多，胞核变大，偶见核分裂现象。解毒组28天2例黑质区有散在软化灶形成，病灶较小，灶内大多数神经元消失，残留的神经元胞体变小，胞核固缩。部分小鼠黑质区可见弥漫性淋巴细胞浸润，偶见淋巴细胞围绕在小血管周围但并未形成血管套。

3讨论

3.1模型的建立和银杏平颤方对PD模型小鼠行为学改善的作用

帕金森病又称震颤麻痹，临床以肢体震颤、木僵为典型症状，是一种好发于老年人的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，同老年痴呆一样是与衰老相关的神经退行性病。目前认为其脑内黑质纹状体的多巴胺能和胆碱能神经功能平和失调是运动障碍的主要原因，凡引起前者功能降低或后者功能亢进的因素均可以导致震颤。帕金森病人的行为变化为运动协调能力降低，在本实验中，用爬杆实验作为测定动物协调运动能力的指标。模型组小鼠协调运动能力明显降低，并且这种行为异常可持续数日，与正常组有显著性差异，这一结果与文献报道一致。

现在世界公认的两种帕金森病模型药物是6－羟基多巴（6-Hydrooxydopamine, 6-OHDA）和MPTP，6-OHDA是一种神经毒素，大鼠单侧纹状体注射微量的6－OHDA，能够造成多巴胺能神经元坏死，经阿朴吗啡诱导，动物可出现向健侧旋转的现象[9－10]，6-OHDA模型存在造模周期长、成功率低、症状不典型等问题，限制了它的应用。

MPTP是哌替啶的衍生物，可由脑中单胺氧化酶B催化生成MPP+，后者是一种选择性的神经毒素，可以损害人类和灵长类动物脑中黑质中的多巴胺能神经元，MPTP最初发现于吸毒患者的脑内，经分离获得该化合物，注射到猴体内可引起酷似临床震颤麻痹患者的几乎全部症状，并且严重程度与所用剂量和动物年龄成正比。最初认为啮齿类动物对MPTP的毒性不敏感，后来发现接受MPTP注射可能导致该动物出现震颤，但是种属差异很大，大鼠由于脑内MAO-B的活性或水平较低，MPTP不能被代谢成活性产物，因而大鼠对MPTP的毒性不敏感。MPTP注射给药可引起小鼠震颤，特别是C57／BL、BABC等，对注射MPTP产生的毒性极敏感， MPTP引起的小鼠行为学异常虽不像在灵长类动物上的症状典型，但造模周期短、重复性好，实验动物费用低，可引起脑内黑质纹状体的多巴胺含量降低，因此，MPTP小鼠模型被国外许多实验室广泛采用，这种模型为研究帕金森病的发病机理和药物治疗提供了条件[11-12]。

MPTP确可引起小鼠的行为异常，但其引起的小鼠行为变化，因采用的注射剂量、注射次数、注射途径的不同以及所采用的行为观察方法的不同而有所不同[13-16]。本实验采用的是最大剂量和最常用的注射途径，为缩短实验周期采用5次注射，得到比较明显的运动能力降低的效用。为了检查PD小鼠的协调运动能力，本实验选用爬杆试验，即让小鼠头向下倒竖于垂直的金属杆顶部，待其四肢握紧杆后，松手任其自由下行，此实验中，动物被动地下行，当协调能力降低时，行为发生明显改变。

实验结果显示， MPTP注射后，小鼠爬杆能力降低，并且这种行为异常可持续几日，以后逐渐恢复，这一结果与文献使用自主活动法观察的结果一致，采用此方法观察得到的银杏平颤方及其拆方对MPTP所致小鼠运动能力降低的改善作用这一结论是可靠的。

3.2银杏平颤方对PD小鼠DA神经元形态的影响

很多实验证实，MPTP对黑质DA能神经元具有选择性神经毒作用，其致病的过程是MPTP进入体内首先穿过血脑屏障，被星形胶质细胞、5－羟色胺能神经元摄取并在单胺氧化酶 B迅速催化下生成吡啶类代谢产物甲基－苯基吡啶离子（MPP+），MPP+与 DA的化学结构极为相似，故可以被DA转运体（DAT）识别并载入DA能神经元内，然后通过线粒体外膜上能量依赖性转运机制进入线粒体集中起来，之后阻断线粒体NADH氧化呼吸链，最终造成ATP衰竭和细胞死亡[17]，故直接损害DA能神经元的是MPP+。因MPP+和铁离子一样与神经黑色素有很高的亲合性，而黑质DA能神经元含有较高浓度的神经黑色素，所以 MPP+选择性地损伤了SNpc的 DA能神经元，中枢神经系统内其它部位的DA能神经元，如腹侧被盖区DA能神经元损伤则很小[18]。笔者在HE染色和TH免疫组化染色实验中也得到同样结果。DA合成限速酶TH与PD的关系很早就受到了普遍关注。TH已经成为DA神经元的标志酶。大量研究证明，PD动物模型及PD病人体内TH从基因表达、酶蛋白含量及分布到酶活性都存在广泛的异常改变，笔者的另一实验观察了各组小鼠中脑TH阳性黑质神经元，结果显示：模型组小鼠中脑SNpc内TH免疫组化观察到大量DA能神经元脱失，因而经黑质－纹状体通路投射到纹状体的DA神经递质减少，从而引起小鼠多巴胺和乙酰胆碱系统平衡失调而产生行为学障碍；HE染色结果与银杏平颤方全方及拆方各组小鼠行为改变成正比，而且黑质区神经元的变性、退化及坏死程度较模型组均明显改善，仅个别小鼠有轻微的软化灶形成。HE染色和TH免疫组化染色结果相吻合，这表明中药可减少多巴胺神经元的丢失、增加多巴胺神经元内TH的表达，各组中药在不同的时间疗效各不相同，就减少多巴胺神经元丢失的数量而言，在14天以解毒组最明显，28天以全方组最明显；就增加TH的表达而言，14天全方组和解毒组较明显，28天化瘀组较明显。这些变化说明中药银杏平颤方全方及拆方能使黑质神经元的损伤程度减轻，结构和功能接近正常，进一步从形态学方面证实了银杏平颤方全方及拆方可保护神经组织免受MPTP引起的自由基增多及氧化损伤所造成的损害，从而为PD的防治提供形态学依据。

以上结果从行为学和神经病理角度分别证明了模型成功。停药后小鼠行为恢复较快与脑内的表现不太相符，这与其他学者的报道一致[19]，具体机制尚不清楚。中药各给药组（14天，28天）小鼠行为障碍有明显恢复、TH免疫组化显示SNpc内DA能神经元数目较模型组明显增多，且全方组和化瘀组更为明显一些。这些结果提示银杏平颤方及其拆方能改善PD小鼠的行为障碍、对DA能神经元的正常形态及功能有保护作用。银杏平颤方及其拆方28天组治疗效果稍好一些，但与14天各组相比两者之间的差别并不很大，一方面提示银杏平颤方及其拆方对PD的治疗可能存在一定的量效和时效关系，同时也说明在短时间内银杏平颤方及其拆方即可达到满意的治疗效果。

参考文献

［1］Graham DG. Catecholamine toxicity: a proposal for the molecular pathogenesis of manganese neurotoxicity and Parkinson's disease［J］. Neurotoxicology，1984,5（1）：83-95.

［2］Floyd RA, Carney JM. Free radical damage to protein and DNA: mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidatie stress［J］. Ann Neurol，1992, 32 Suppl:22-27.

［3］Perry TL, Godin DV,Hansen S.Parkinson's disease:a disorder due to nigral glutathione deficiency［J］.Neurosci Lett，1982，33（3）:305-310.

［4］Peny TL,Yong VW． Idiopathic Parkinson's disease，progressive supranuclear palsy and glutathione metabolism in the substantia nigra of patients［J］.Neurosci Lett，1986，67（3）：269-274.

［5］Sofic E, Lange KW,Jellinger K,et al.Reduced and oxidized glutathione in the substantia nigra of patients with Parkinson's disease［J］.Neurosci Lett，1992，142（2）:128-130.

［6］徐叔云.实验药理方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1982：470.

［7］Nobutaka A,Yoshio G. Evaluation of a 1-methyl -4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine (MPTP),treated C57 black mouse model for parkinsonism[J].Brain Res,1990,515:57-63.

［8］施新猷.医学动物实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1980：210.

［9］Hefti f, Eng A, Melaned E.Partial lesions of the nigrostrital pathway in the rat［J］.Neuropharmacol，1985, 24:19-25.

［10］高占国，刘传缋.MPTP的神经毒性与帕金森动物模型［J］. 国外医学•神经病学神经外科学分册 ，1995, 22(5):229-232.

［11］蔡元奋. 神经毒素MPTP处理之老年大鼠可作为研究帕金森氏症候群的动物模型［J］.生理科学进展，1997，28（1）：58-60.

［12］Arial N K, Misuqi Y, Goshima YM. Evaluation of a l-methyl-4-phenyl- 1,2,3, 6,-tetrahydropyridine(MPTP)-treatedC57BlackmouseforParkinsonism［J］. Brain Res，1990,515:57-63.

［13］Sonsall PK, Heikkila RE. The influence of dose and dosing interval on MPTP-imduceddopaminergic neurotoxicity in mice［J］. Eur J Pharmacol，1986,129(3):339-45.

［14］Mohammad Tariq,Haseeb Ahmed Khan.Effect of chronic administration of magnesium sulfate on 1-methy1-4-phenyl-1,2,3,6,-tetrahydropyridine induced neurotoxicity in mice［J］.Pharmaco Toxicol，1998,82:218-222.

［15］Rozas G,Lopez MT,Guerra MJ,et al.The overall rod performance test in the MPTP-treated-mouse model of Parkinsonism［J］.J Neurosci Methods，1998,83(2):165-175.

［16］Miller DB， Reinhard Jr J F, Daniels AJ,et al. Diethyldithiocarbamate potentiates the neurotoxicity of in vivo 1-methy1-4-phenyl-1,2,3,6,- tetrahydropyridine and in vitro 1-methy1-4-phenylpyridinium［J］.J Neurochem,1991,57:541-549.

［17］Dexter DT,Caraon A,VidaAhet M,et al.Decreased ferritin levels in brain in Parkinson's disease［J］.J Neurochem,1990,55(1):16-20.

［18］Sengstock GJ,Olanow CW, Dunn AJ,et al.Progressive changes in striatal dopaminergic markers,nigral volume, and rotational behavior iron infusion into the rat substantia nigra［J］.Exp Neurol,1994,130(1):82-94.

［19］Good PF, Olanew CW, Perl DP. Neuromelanin-containing neurons of the substantia nigra accumnulate iron and aluminum in Parkinson's disease: A LAMMA Study［J］.Brain Res,1992,593(2):343-346.