油菜转基因技术研究进展

摘要 随着转基因技术的深入发展，用于转化的目的基因越来越多。目前转基因技术已运用到油菜研究的各个领域。本文概述了油菜转基因研究的几个方向以及基因转化方式，并探讨了油菜转基因研究中的一些问题。

关键词 油菜；转基因技术；目的基因

中图分类号 S565.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）02-0020-03

Abstract With the deeper development of transgenic technology，the target genes used in transformation are increasing. Nowadays， transgenic technologies have been applied to various fields of rapeseed researchs. This paper summarized several directions for the transgenic research on rapeseed and gene transformations，and discussed some problems in the transgenic research on rapeseed.

Key words rapeseed；transgenic technology；target gene

油菜是我国第一大油料作物，常年种植面积超过666.67万hm2，总产量约1 400万t，年产菜籽油约500万t，占自产植物油总量的45%[1-6]。在我国，油菜的育种和改良工作一直都受到重视。长期以来传统的常规育种技术在油菜品种选育改良方面取得了一定的成功，选育出了很多具有代表性的新品种，但同时也存在诸如缺乏亲本材料、远缘杂交不亲、选育年限过长等问题。转基因技术是油菜育种的辅助手段，广泛应用于杂种优势、提高油脂量、油菜品质改良、抗除草剂、抗病虫等方面[1-7]。

1 油菜转基因的目的

近年来，基因转化的目的主要有研究植物基因调控机理以及功能基因，选育抗病、抗虫、高产、优质等符合育种目标的品种，对受体植物进行遗传及品质改良，拓展植物分子遗传学基础理论[7]。在油菜转基因应用上，目前可查的就有40多种基因，这些基因主要用来改良油菜品质，提高油菜含油量，改善菜籽油品种以及其他抗虫、抗除草剂等抗性改良[8-9]。

1.1 改良品质

油菜品质改良是油菜育种的一个重要方向，通过转基因技术改良油菜品质的研究已见报端。石东乔等[10]为获得低含量亚油酸、亚麻酸，高含量油酸的油菜种子，通过利用农杆菌介导法在油菜中导入反义的油酸脱饱和酶基因而获得转基因油菜植株。陈锦清等[11]为获得高含油量的转基因油菜，将反义PEP基因导入油菜。Vesna Katavic[12]将拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因导入甘蓝型油菜中，提高了芥酸含量。有诸多研究报道通过特定基因的导入可明显提高油菜含油量[13-14]。

1.2 抗虫害

基因工程的另一个重要应用领域是培养抗虫植物，以改良作物。抗虫的CpTI、Bt基因已成功地在油菜中进行了转化。官春云等[15]将Bt毒蛋白基因成功地转化到甘蓝型双低油菜品种湘油13号，获得稳定的转Bt基因油菜品系。俄罗斯科学院植物生理研究所已筛选出抗卡那霉素的油菜苗[1-5，16]。侯丙凯等[1-5，17]利用基因枪法将抗虫基因cry1Aa10定点整合到油菜叶绿体基因组并获得抗虫转基因植株。周小梅等[18]用农杆菌转化芥菜型油菜，获得具有抗病虫性的油菜转化体。有学者为获得抗虫的转基因植株[19]，通过用农杆菌共培养法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜而实现。

1.3 抗除草剂

为更好地选择除草剂，提高除草剂的安全性，将除草剂抗性引入农作物是一条途径，目前已培育出部分抗除草剂的油菜品种。将抗除草剂溴苯腈基因bxn转入油菜也获得抗溴苯腈转基因植株[20]。有研究将抗草甘膦的EPSP合成酶基因从大肠杆菌突变株中克隆出，并将该基因导入到油菜中，成效很好，加拿大已有2个抗草甘磷的，且产量与当前品种相当，品质和抗性得到提高的转基因油菜品系[1-5，21]。

1.4 抗病害

抗病毒的转基因材料，可通过克隆植物抗病基因，将植物病毒的外壳蛋白基因转移到植物中获得。王新发等[22]获得了油菜转基因恢复系和保持系植株。黄永菊等[23]以抗（耐）、感病品种（系）为材料研究油菜菌核病的遗传力发现，油菜菌核病抗性主要受核基因控制，并存在一定的母性效应。张海燕等[24]为获得抗病毒转基因油菜，通过用激光微束穿刺法将商陆病毒蛋白导入油菜中而实现。此外，通过转基因技术已获得了抗菌核病的油菜植株[17，25-26]。有研究用微注射法将烟草花叶病毒基因转入白菜型油菜。

1.5 杂种优势利用

传统油菜杂种优势利用途径育种时间长、育性不稳定后代有分离、杂种纯度不高等缺陷，限制了杂种优势的发挥，利用转基因技术可很好地解决这一矛盾，具有很高的研究价值。目前，此类研究还处于基础阶段，鲜有转育成的不育和恢复系报道。Mariani等[27]利用核糖核酸酶和TA29启动子，获得油菜的不育和恢复植株。陈社员等[28]将不育基因barnase导入到湘油15号，通过多代回交选育，获得遗传稳定的转基因雄性不育系15A。

2 油菜转基因方法

新的植物遗传转化方法不断被探索、发展，目的是将外源基因方便有效地导入植物体内。在转基因研究中，植物遗传转化是关键步骤之一。转基因技术的不断发展为油菜遗传转化提供了多样化的选择，可分为农杆菌（发根农杆菌）介导遗传转化（也称生物介质介导的遗传转化）或直接通过电击、基因枪、激光微束穿刺、显微注射、花粉管、PEG介导等方法进行转化。

2.1 种质系统介导转化法

借助生物体自身的种质细胞为媒体，尤其是植物的花粉、子房、幼胚、卵细胞等生殖系统的细胞以及细胞结构来实现转化之目的，简便易行，不需建立离体培养体系。本方法主要是将外源DNA注射入种胚、子房、幼穗中，进而获得转基因植株。种质系统介导基因转化的DNA可以是重组在质粒上的，也可以是的[1-5]。

2.2 生物介质介导的遗传转化

根癌农杆菌和发根农杆菌是目前应用的主要生物介质，它们转化的原理分别是通过活化Ti和Ri质粒的Vir区基因转移T-DNA[1-5]。Moloney等认为子叶柄切面的薄壁细胞的再生能力强，且很易受农杆菌感染[29]。Boulter等认为较之发根农杆菌，根癌农杆菌转化频率高，并能直接从农杆菌转移基因到植物细胞核基因组[30-31]。

2.3 PEG介导法

Krens等[1，32]首先建立聚乙二醇（PEG）介导法，该法操作简单、处理量大、融合频率高，且不影响再生，基本上已克服了再生植株嵌合体的发生，其主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA[1-3]。该法不需要昂贵的仪器设备，但培养和处理原生质体的时间长，且处理效果无法把握，多元原生质体融合体常常形成。Nugent等[33]报道用PEG介导油菜原生质体和细胞核的转化，并比较对其的转化。Parihar等[34]研究认为在甘蓝型油菜中，DNA摄入和外源基因表达的提高可通过低剂量的紫外线实现。

2.4 基因枪法

基因枪法最早是由Sanford等于1987年提出的，目前应用于十几种植物（诸如油菜、水稻、玉米、小麦等）中。为达到稳定遗传和表达，基因枪法通过高压将包被外源DNA 的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织[1-5]，使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中。Cheng Lin等[35]利用基因枪法转化油菜子叶柄叶绿体基因组的研究表明油菜可能是一种适合叶绿体遗传转化的作物。侯丙凯等[14]在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合，其通过基因枪法将苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因（Bt）转入油菜而实现。

2.5 激光微束穿刺法

激光微束穿刺法操作简单、重复性好、受体材料广泛、对细胞损伤小、靶向性极强，其原理是利用聚焦到的激光微束（微米级）穿刺组织，导致细胞膜的可逆性穿孔，进而导入外源DNA。但该法设备复杂、转化效率不高、费用较高。王兰岚等[36]在世界上率先得到有分子证据的稳定转化植株，其通过一套用激光微束向植物细胞导入外源DNA的体系获得。Weber等[37]证实了激光微束可定向地穿透细胞壁和质膜，将外源基因导入细胞和细胞器中。

2.6 显微注射法和电激法

显微注射法是利用显微注射仪将外源基因直接注入到生物的生殖细胞中，从而获得转基因再生植株。该方法的过程非常复杂、技术难度大，必须以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础，必须建立固定植物细胞或原生质体的技术，因此使用率不高。电激法是利用高压电脉冲作用，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入。电激法操作简单、转化效率高，但仪器昂贵，较易损伤原生质体，原生质体的分离和再生较困难[1，38]。

3 油菜转基因存在的问题

随着转基因植物环境释放种类增多、规模增大，人们关注的热点是转基因植物释放后可能引起的种种问题。转基因植物释放后，可以通过种子或花粉将导入的基因从基因修饰植物向非且标植物或杂草扩散[1-5]。因此，在推广应用转基因油菜前必须严格审定程序，并评估其环境安全性。

油菜转基因体系日臻成熟，油菜转基因技术及其应用已取得了长足的进展，但目前仍有许多问题有待解决。

目前，油菜基因转化主要存在转化效率低、遗传稳定性差、无法预测基因的插入位点、定点整合等问题[3-5]。油菜转化体系的稳定性及转化率不高。研究表明，湿度、光照、基因型、苗龄、受体材料等环境因子及抗生素、植物激素、Ag+离子等是影响油菜遗传转化体系建立的主要因素。应用于基因改良的油菜栽培品种越来越多，特别是优化油菜转化体系[1-5]，可趋向稳定油菜遗传转化体系，特别是农杆菌介导的花絮浸泡方法，不受限于品种。

油菜外源基因的表达调控及其遗传稳定性不高，随机导入的外源基因整合到油菜基因组中，会产生不确定性，表现为其表达部位、表达水平、表达时间等的不确定。另外，随机插入外源基因，其在油菜基因组中的拷贝数是不确定的[1-5]，常常会出现嵌合体现象或出现外源基因沉默。而采用使用其本身特定的启动子、优化转化方法等策略，可以避免这些问题。

转基因作物的安全性一直以来是个重要问题，既要考虑到转基因油菜环境释放后是否会危害或影响其他生物[1-5]，又要考虑到转基因油菜环境释放后，遗传物质的横向传递对一些野生物种尤其是亲源关系很近的植物可能会造成污染。Gressel[39]报道了转基因油菜种子特性表达基因的漂流问题。转基因油菜在食用方面的安全性问题亟需进一步的科学验证。

植物基因工程的研究与应用已取得了重大的进展，是大势所趋，且不可逆转。转基因油菜的研究与生产备受各界瞩目，油菜在保障我国油品安全方面的地位举足轻重，运用分子生物技术是大势所趋[40-44]。

4 参考文献

[1] 涂世伟，郭万里，蒋立希，等.油菜遗传转化方法的研究进展[J].浙江师范大学学报：自然科学版，2012（3）：338-345.

[2] 咸拴狮，罗晓丽，王剑.油菜转基因研究进展[J].山西农业科学，2006（3）：85-88.

[3] 任佑华.天麻抗真菌蛋白基因导入甘蓝型油菜的研究[D].长沙：湖南农业大学，2006.

[4] 苏丹.草甘膦氧化还原酶基因转化油菜的研究[D].呼和浩特：内蒙古大学，2008.

[5] 刘晓，景寅.转基因油菜研究进展[J].现代农业科技，2010（9）：80-81.

[6] 沈金雄，傅廷栋.我国油菜生产、改良与食用油供给安全[J].中国农业科技导报，2011，13（1）：1-8.

[7] 孙万仓.转基因研究进展[J].西北农业学报，2000，9（3）：117-121.

[8] 段英姿，牛应泽，郭世星.油菜基因工程研究进展[J].中国农学通报，2003，19（5）：92-98.

[9] 刘晓，景寅.转基因油菜研究进展[J].现代农业科技，2010（9）：80-81.

[10] 石东乔，周奕华，张丽华，等.农杆菌介导的油菜脂肪酸调控基因工程研究[J].高技术通讯，2001（2）：1-7.

[11] 陈锦清，朗春秀，胡张华，等.反义PEP基因调控油菜籽粒蛋白质/油脂含量比率的研究[J].农业生物技术学报，1999，7（4）：316～320.

[12] VESNA KATAVIC，WINNIE FRIESEN，et al.利用拟南芥的FAEI基因和酵母的SLCI-l基因通过生物技术提高油菜芥酸含量的尝试[J].国外作物育种 2001，20（4）：37-44.

[13] 傅廷栋.中国油菜生产和产品改良的现状与前景[J].安徽农学通报，2000，6（1）：2-8.

[14] 侯丙凯，陈正华.苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因克隆及油菜叶绿体遗传转化研究[J].遗传，2001，23（1）：39～40.

[15] 官春云，王国槐，陈社员，等.转基因抗虫油菜品系选育和性状研究[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2000，26（5）：335-336.

[16] 官春云，李.转基因油菜应用研究[J].细胞生物学杂志，1997，19（1）：18-23.

[17] 侯丙凯，胡赞民，党本元，等.定点整合抗虫基因到油菜叶绿体基因组并获得转基因植株[J].植物生理与分子生物学学报，2002，28（3）：187-192.

[18] 周小梅，李君剑，赵军良，等.农杆菌介导抗虫基因转化芥菜型油菜的研究[J].山西大学学报（自然科学版），2005，28（2）：192-195.

[19] 李学宝，郑世学，董五辈.甘蓝型油菜抗虫转基因植株及其抗性分析[J].遗传学报，1999，26（3）：262-268.

[20] 钟蓉，朱峰，刘玉乐，等.油莱的遗传转化及抗溴苯腈转基因油菜的获得[J].植物学报，1997，39（1）：22-27.

[21] 孙万仓.转基因研究进展[J].西北农业学报，2000，9（3）：117-121.

[22] 王新发，王汉中，刘贵华，等.导入双价基因的转基因杂交油菜亲本及其对菌核病抗性的研究[J].植物学通报，2005，22（3）：292-301.

[23] 黄永菊，陈军，李云昌.甘蓝型油菜菌核病抗（耐）性的遗传研究[J].中国油料作物学报，2000，22（4）：49-51.

[24] 张海燕，党本元，周奕华，等.利用激光微束穿刺法将PAPcDNA导人油菜获得抗病毒转基因植株[J].中国激光，1999，26（11）：1053-1056.

[25] 蓝海燕，王长海，张丽华，等.导入B-1，3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究[J].生物工程学报，2000，16（2）：142-145.

[26] 张丽华，党本元.抗菌核病转基因油菜植株的获得[J].高技术通讯，1999（12）：41-46.

[27] MARIANI C，DE DEUCKELEER M，TRUETTNER J.Induction of male sterility in plants by chimaeric Ribonuclease gene[J].Nature，1990，347（25）：737-741.

[28] 陈社员，官春云，刘忠松，等.转基因抗除草剂油菜杂种优势利用系统研究Ⅰ转基因雄性不育系15A选育[J].作物研究，2015，29（2）：128-131.

[29] MOLONEY T A，WOORREL ACETAL.Fatty aid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants[J].Science，1992（257）：72-74.

[30] BOULTER ME，CROYE，SIMPSON P，et al.Transformation of Brassica napus L.（Oilseed Rape）using agrobacterium tumefaciens and agrobact-erium rhizogenes：A comparison[J].Plant Sci，1990，70：91-99.

[31] 任佑华，任佐华.基因工程技术在油菜遗传改良中的应用[J].现代农业科技，2008（8）：104-106.

[32] KRENS F A，MOLENDIJK L，WULLEMS G J，et al.In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA[J].Nature，1982，296（5852）：72.

[33] NUGENT GD，COYNE S，NGUYEN T T，et al.Nuclear and plastid trans-formation of Brassica oleracea var. botrytis（cauliflower）using PEG-mediated uptake of DNA into protoplasts[J].Plant Science，2006，170（1）：135-142.

[34] PARIHAR D S，MAHESHWARI S C，KHURANA P.Influence of heat shock and UV irradiation on PEG-mediated DNA uptake and transient expression of nptII gene in protoplasts of Brassica napus[J].Indian Journal of Experimental Biology，1998，36（10）：1002-1006.

[35] CHENG LIN，LI HEPING，QU BO，et al.Chloroplast transformation of rapeseed（Brassica napus）by particle bombardment of cotyledons[J]. Plant Cell Reports，2010，29（4）：371-381.

[36] 王兰岚，宋桂英，张健，等.利用微束激光将外源基因导入小麦幼胚并获得转基因植株的研究[J].激光生物学，1993，2（2）：277-278.

[37] WEBER G，MONAJEMBASHI S，GREULICH K，et al.Genetic manipu-lation of plant cells and organelles with a laser microbeam[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1998，12：219-222.

[38] 黄洪云，那日.电激法介导作物种子基因转移的研究与进展[J].种子，2007，26（2）：52-55.

[39] GRESSEL J.Gene flow of transgenic seed-expressed traits：biosafety considerations[J].Plant Science，2010，179（6）：630-634.

[40] 骞宇.农杆菌介导法将水稻几丁质酶基因导入油菜的研究[D].成都：四川大学，2004.

[41] 黄胜和.月见草6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与异源表达[D].呼和浩特：内蒙古大学，2009.

[42] 潘刚，周永明.甘蓝型油菜遗传转化的研究进展[J].中国油料作物学报，2003（3）：90-98.

[43] 于晓玲，李春强，彭明.植物原生质体技术及其应用[J].中国农学通报，2009（8）：22-26.

[44] 陈光尧，王国槐，唐小彦.油菜转基因抗性育种研究进展[J].作物研究，2006（5）：442-445.