微藻色素及其提取研究

摘要:微藻是地球上最早的生物物种,它们能十分有效地利用太阳能将H2O、CO2和无机盐类转化为有机资源,是地球有机资源的最初级生产力,藻类不仅富含蛋白质、脂肪和碳水化合物这三大类人类所必需的要素,而且还含有多种色素等生物活性物质,是人类向海洋索取食品、药品、燃料、生化试剂、精细化工产品以及其他重要材料的一种方式。

关键词:微藻色素提取

中图分类号:Q945文献标识码:A文章编号:1672-3791(2011)09(c)-0161-02

微藻一直以来被人们作为鱼、虾、贝类幼体或成体的直接或间接的活饵料,近年来,人们逐渐注重微藻生物活性物质的研究和开发。微藻中存在着丰富的、结构独特的生物活性物质,其中有许多具有药理活性,是十分丰富的高价值化学品及药品的来源,在医药和保健品的开发应用方面具有巨大的潜力,目前,藻类生物技术的研究开发遍及世界各地,从微藻中提取色素、微藻多糖、多不饱和脂肪酸等活性物质在当前都有研究,并取得了一定的成果,本文综述了小球藻各种活性成分及提取方法。

从微藻中提取的色素主要有β-胡萝卜素、虾青素和藻蓝素等。β-胡萝卜素是VA的前体,有抗氧化、抗突变、抗衰老、预防癌症、增加免疫力等作用。虾青素具有很强的抗氧化功能,能清除体内自由基,对紫外线引发的皮肤癌有很好的治疗效果,还能显著促进机体抗体的产生。藻蓝素亦称藻蓝蛋白,是一种安全无毒的色素蛋白,能促进血细胞再生,是一种理想的光敏剂,国外已用于癌症的光动态治疗。藻蓝蛋白是天然蓝色素的巨大资源宝库,可取代合成色素用于仪器、医药和化妆品工业,高纯度的藻蓝蛋白是一种荧光分子探针,它与其他配体分子结合后,可以标记各种生物大分子,用于生物分子试剂。目前从螺旋藻中提取藻蓝蛋白已在日本进行商业化生产。

由于微生物具有可工业化规模培养,不受季节、气候和环境条件的限制,以及易于进行菌种改良等优势,利用微生物合成类胡萝卜素是获得天然类胡萝卜素的最有希望的途径之一。在高等植物、藻类、某些真菌和细菌细胞中均存在类胡萝卜素的生物合成途径,通过多年来在生化分析、经典遗传学和分子生物学方面的研究,目前已基本清楚了类胡萝卜素合成的主要代谢途径,但对于复杂类胡萝卜素的末端修饰、甲基化以及多烯烃链的修饰等过程仍未完全了解。营养和环境条件的改变通常对类胡萝卜素具合成有明显影响。较低的碳源浓度一般认为有利于类胡萝卜素的合成。氮饥饿(即高C∶N比)被认为有利于杜氏藻、蓝细菌、三孢布拉霉和雨生红球藻的类胡萝卜素合成。无机盐对类胡萝卜素合成的影响不如氮源显著,据报道,磷酸盐和硫酸盐浓度的限制有利于杜氏藻的类胡萝卜素合成而不利于细胞生长。光照是类胡萝卜素合成中的重要影响因子之一,适度的光照有利于类胡萝卜素的积累。提高温度对雨生红球藻的类胡萝卜素积累有利。中性或稍碱性的pH有利于红球藻中虾青素的积累。关于通气量对类胡萝卜素合成影响的报道较少,对法夫酵母的研究表明,通气量的增加有利于其虾青素的积累。

超临界CO2流体萃取在类胡萝卜素提取中的应用越来越广,超临界流体萃取是利用超临界流体的特性而发展起来的一门新兴提取技术。所谓超临界流体是处于临界温度和临界压力以上、介于气体和液体之间的流体,超临界流体兼有气体和液体的双重性质和优点:粘度小,接近于气体,而密度则接近于液体,其扩散系数为液体的10～100倍,具有良好的溶解特性和传质特性。在临界点附近,温度和压力的微小变化可导致超临界流体物化性质的显著改变。因此,通过温度和压力的改变可以使超临界流体具有选择性溶解物质的能力。利用超临界流体的这些性质,从混合物中选择性地溶解其中某些组分,将其分离析出的化工分离手段即为超临界流体萃取。目前,超临界流体萃取在食品工业中广泛应用,如啤酒花有效成分的萃取、天然香料植物或果蔬中提取天然香料和色素及风味物质、动植物油中提取植物油脂、咖啡豆或茶叶中脱去咖啡因、烟草脱尼古丁及食品脱溶等。在超临界流体萃取中最常用的的溶剂体系为超临界CO2,它具有无毒、无污染和易分离等优点。由于超临界CO2的极性较小,一般适用于选择性萃取非极性或弱极性的物质。目前关于采用超临界流体萃取β-胡萝卜素和番茄红素的研究报道较多,但关于叶黄素超临界流体萃取的研究报道则很少。

叶黄素又名黄体素,归属于类胡萝卜素族,是含氧类胡萝卜素—类叶黄素中的一种,广泛存在于花卉、水果蔬菜等植物中。叶黄素为橙黄色粉末,浆状或深黄棕色液体,有弱的干草气味,不溶于水,溶于丙酮、甲醇、乙烷、甲乙酮和二氯乙烷,耐热性能好。叶黄素的分子式为C40H56O2,分子量568.9,具有两个紫罗兰环,对叶黄素化学结构的研究表明:它具有3个属性中心,8种立体异构体,但自然界中实际上只存在一种异构体。由于工艺复杂,难以通过化学方法人工合成单一异构体的叶黄素。目前的研究显示,只有从天然植物中提取得到的叶黄素才具有抗氧化的生物活。

作为一种天然黄色素,叶黄素可用作食品、医药和化妆品的色素添加剂和家禽畜、动物组织的增色剂等。此外,科学研究证实,叶黄素能够有效抵御自由基对人体细胞与器官造成的损伤,防止机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤等疾病;激发免疫反应,提高机体免疫力;防治年龄相关性视黄斑退化引起的视力下降和失明等。

叶黄素的生产工艺基本上为有机溶剂提取,所使用的溶剂包括环己烷、石油醚、丙酮、乙醇和四氢呋喃等。异养培养的小球藻细胞中叶黄素含量可达2～4mg/g细胞干重,小球藻中的叶黄素绝大部分以游离形式存在,更易于提取和分离纯化。采用现代工业发酵技术高密度异养培养小球藻作为叶黄素来源,还具有生产效率高,不受季节、气候及地域条件限制,占地面积小,产品质量稳定等优势。此外,由于小球藻中除叶黄素之外还富含其他多种营养成分,以小球藻作为叶黄素源进行叶黄素提取后,还可以实现萃余组分的综合利用,提高经济效益。

目前国内外一些学者对通过微藻培养生物合成叶黄素进行了研究。叶黄素的提取是叶黄素规模化生产中十分重要的下游环节,与叶黄素的最终产品质量和生产成本密切相关。目前所报道的叶黄素提取方法有多种,有机溶剂提取是应用最为广泛的叶黄素提取方式,也是目前在规模化生产中从万寿菊中提取叶黄素所普遍采用的工艺,采用二氯甲烷提取,然后用低浓度乙醇水溶液洗去杂质,再通过减压蒸发除去溶剂,将固形物用乙醇重新溶解,用正己烷萃取杂质,再将水稀释乙醇使叶黄素结晶,最终得到纯度为90％～98％的叶黄素,收率为85％～90％;高速逆流色谱法以小球藻的叶黄素粗提取物为原料,采用正己烷－甲醇－水(4∶3∶1)组成的溶剂系统,经过一步分离达到了98％的叶黄素纯度;闪柱色谱法用乙醚－正己烷(1∶1)提取经气流粉碎后的小球藻粉中的类胡萝卜素,然后采用闪柱色谱法,先后用正己烷和正己烷－丙酮－氯仿(7∶2∶1)进行洗脱,得到99％以上纯度的叶黄素,收率为60％;双水相萃取法用小球藻湿重30％的乙醇提取小球藻藻泥,然后以此粗提取物为材料,研究了叶黄素在PEG－磷酸盐双水相系统中的分配行为,该法叶黄素的收率达到81.0%。

叶黄素的分离检测采用分光光度法测定了叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和类叶黄素的含量;采用高效液相色谱法研究了普通小球藻中色素的组成;采等用高效液相色谱法分离同时检测了普通小球藻中的类胡萝卜素和叶绿素;使用C30柱分离和检测了小球藻片剂中包括叶黄素在内的32种类胡萝卜素;采用反相C18柱分离检测叶黄素的高效液相色谱方法,通过梯度洗脱方式有效地实现了叶黄素的分离检测。

虾青素是一种重要的类胡萝卜素,它广泛存在于生物界,特别是鱼、虾、蟹等水生生物之中。虾青素可淬灭单线态氧,清除自由基,阻止脂质过氧化,保护机体免受伤害,预防癌症发生,还能促进人体免疫球蛋白的产生,具有很高的免疫调节活性。研究表明,虾青素具有抗氧化活性,虾青素的抗氧化性比β胡萝卜素高约10倍,比维生素E高约500倍,被认为是“超级维生素E”。

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,是一类含脂的色素家族,位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光,所以叶绿素呈现绿色,它在光合作用的光吸收中起核心作用。微藻中含有大量的叶绿素。将一定量的小球藻培养液离心得藻泥,用80%的丙酮于4℃下浸泡藻泥,提取叶绿素,至藻泥变灰白色后,离心(3000r·min-1,10min)得上清液。重复两次,合并各次上清液,即为小球藻叶绿素提取液,于分光光度计上检测叶绿素提取液在645nm和663nm处的吸光度值(A645和A663),按下式换算叶绿素a,叶绿素b及总叶绿素含量(分别用A,B,C表示)。

Ca(mg·L-1)=12.7A663－2.69A645

Cb(mg·L-1)=22.9A645－4.68A663

A(mg·L-1)=Ca×n×V0/V

B(mg·L-1)=Cb×n×V0/V

C(mg·L-1)=A+B=(Ca+Cb)×n×V0/V

式中:Ca为叶绿素提取液的稀释液中叶绿素a的含量(mg·L-1);

Cb为叶绿素提取液的稀释液中叶绿素b的含量(mg·L-1);

n为稀释倍数;

V0为叶绿素提取液体积(mL);

V为用作稀释的叶绿素提取液的体积(mL);

总叶绿素=8.02×A663+20.2×A645来计算叶绿素的含量。

总之,微藻是天然色素的重要来源之一,其色素的色价高、稳定性好以及抗氧化性高,且天然色素具有安全和健康的效果。所以微藻色素在将来的市场前景广阔,是一类很重要的色素来源和营养物来源。

参考文献

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