四唑染色法快速测定茄子种子生活力的研究

摘要：根据四唑（2，3，5-Triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色法测定种子生活力的原理，研究不同浓度四唑溶液、不同染色温度和不同染色时间对茄子（Solanum melongena L.）种子生活力的影响，探索测定茄子种子生活力的最佳条件。结果表明，四唑溶液浓度、染色温度、染色时间三者之间存在一定的相关性，通过改变三者中的一者或两者可以达到改变其他两者或一者的目的，因此，可根据实际需要来确定测定条件。在比较四唑染色法测定茄子种子生活力的不同条件后，认为处理组合11（浸种温度20 ℃、浸种时间18 h、染色液浓度1.0%、染色温度35 ℃、染色时间18 h）为最理想的处理组合，是TTC法快速测定茄子种子生活力的适宜方法。

关键词：茄子（Solanum melongena L.）；种子；生活力；四唑染色法

中图分类号：S641.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2572-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.10.030

Abstract： Based on the principle of tetrazolium （2，3，5-Triphenyl tetrazolium chloride， abbreviation TTC） staining method for determination of seed viability，the effects of concentration of tetrazolium solution， staining temperature and staining time on seed viability of early-maturity eggplant （Solanum melongena L.） were studied to figure out the optimum conditions for determination of eggplant seed viability. The results showed that there was a certain correlation among the concentration of tetrazolium solution， staining temperature and staining time，by changing one or two factors of the three can achieve the purpose of changing the other two or one factor，therefore，it’s possible to determine the optimum conditions according to actual need. After comparing the different combinations of conditions of TTC method for testing early-maturity eggplant seed viability，it was concluded that processing combination 11（soaking seeds in water at 20 ℃ for 18 h，concentration of the tetrazolium solution at 1.0%，staining at 35 ℃ for 18 h） is the optimum processing combination， thus suitable for rapid determination of early-maturity eggplant seed viability.

Key words： eggplant（Solanum melongena L.）； seed； viability； tetrazolium staining

茄子（Solanum melongena L.）起源于印度、缅甸及邻近地区，古称酪酥、昆仑瓜等。其产量高、适应性强、结果期长，现在全世界都有分布，以亚洲面积最大[1]。中国是世界上最大的茄子生产国[2]，茄子栽培面积达73.67万hm2，占世界总面积的49.16%[3]。茄子种植区域广，种子用量大，但是休眠现象比较普遍[4]。如何快速测定茄子种子的生活力、确定茄子种子的最大发芽潜力、评定种子质量、为种子生产和销售提供参考依据等就成为当前休眠茄子种子急需解决的主要问题。种子生活力的快速测定法主要有四唑（2，3，5-氯化三苯基四氮唑；2，3，5-Triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色法、溴麝香草酚兰（BTB）法和紫外荧光法等，其中以TTC染色法应用最广。其原理为有生活力的种子胚细胞含有脱氢酶，具有脱氢还原作用，被种子所吸收的无色TTC接受了活种子呼吸过程中脱氢酶产生的氢，而变成还原态的红色稳定不扩散物质[5]，即不溶于水的三苯基甲腙（TTF），而无生活力的种子则无此反应，故无染色出现，由此可按胚组织的染色情况区分有生活力的种子和无生活力的种子[6]。现在国际种子检验规程（International Rules for Seed Testing）已成为农业、园艺和林木的部分种子种类及应用范围内各类种子的鉴定标准[7]，但迄今为止工作比较集中于木本植物及麦类、豆类、玉米、棉花等大田农作物种子；对蔬菜而言，除番茄属作物外，其他蔬菜种子鉴定尚未列入此检验规程鉴定范围。TTC测定技术在国内农林生产上尚未普遍应用，相关研究和报道极为匮乏。综合现有的有关资料，农作物种子生活力相关研究较多，但也只是局限于水稻[8]、小麦[9]、玉米[10]等粮食作物；而蔬菜种子生活力测定方法的研究极少，仅在番茄[11]、苦瓜[12]、冬瓜[13]等方面有部分报道。由于四唑染色法测定茄子种子生活力的试验前人涉及较少，到目前为止，茄子种子生活力的具体鉴定标准和茄子种子四唑染色图谱尚未见报道。为此，试验以茄子种子为材料，采用TTC法测定茄子种子的生活力，比较快速预测茄子种子最大发芽潜力的适宜方法，探索茄子种子生活力四唑测定值与发芽率之间的数量关系，评价TTC法用于茄子种子生活力预测的可行性，从而为茄子种子生产和销售提供参考依据，并为茄子种子生活力TTC测定法早日列入国家农作物种子检验规程和国际种子检验规程奠定基础。

其余的各处理组合均选取了具有代表性的着色较为清晰的种子，纵切后在体视显微镜下观察种子的切面染色效果，以区分种子胚各部分的着色情况，从而辨别种子的生活力。处理组合2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24的种子切面染色结果分别见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16。从上面这些着色种子纵切面在显微镜下观察采集的图像可以发现，图4（处理组合6）、图7（处理组合11）、图8（处理组合12）、图12（处理组合18）、图13（处理组合20）、图14（处理组合21）的染色情况较为清晰。再结合表2中各处理组合的着色种子数目及方差分析结果，发现图13和图14虽然较为清晰，但其处理组合20和21着色种子数目仅有72±3粒和68±3粒，均没有反映出供试材料的实际生活力情况，故处理组合20和21不适合茄子种子生活力测定的最佳条件；而图4（处理组合6）、图7（处理组合11）、图8（处理组合12）、图12（处理组合18）的着色种子数目分别为91±2、97±3、94±4、92±2粒，相互之间也没有出现极显著差异（P>0.01），其中处理组合11着色种子数目最多，为97粒，且染色时间较短，为18 h，其余3个处理组合染色时间均为36 h，考虑染色时间对试验周期的影响，故选择处理组合11作为TTC法快速测定茄子种子生活力的理想处理组合。

3 小结与讨论

采用TTC法测定种子的生活力，在染色前的准备阶段，国际种子检验规程中规定茄科番茄属的番茄种子需要将种子纵切为两半，以方便观察切面的染色情况。而茄子种子体型较小，种皮表面光滑，不易切开。试验经过多次探索，发现用解剖刀在浸种后快速人工去皮、并在适宜的条件下染色，则效果较好。在茄子种子经剥皮染色之后，及时统计每组种子着色情况，选取每组有代表性的着色种子进行纵切，则此时纵切较易操作，接着在体视显微镜下观察种子的切面染色效果，区分种子胚各部分的着色效果，就可辨别种子是否具有生活力。

通过试验发现，在种子染色阶段，染色时间1 h过短，不适于茄子种子的生活力测定。这很可能是由于染色时间过短，活种子呼吸过程中脱氢酶产生的氢非常有限，来不及与四唑染色液充分反应造成的。若是染色液浓度（1.0%）较高、染色温度（35 ℃）较高、染色时间延长，则均有利于茄子种子的生活力测定。但在较高的染色液浓度时，染色温度较高，同时染色时间（36 h）过长，则茄子种子的染色效果反而下降，这可能是由于种子长时间处于较高的染色温度条件下内部某些物质结构遭到破坏、导致种子生活力下降引起的。

试验得到的TTC法快速测定茄子种子生活力的理想处理组合为处理组合11，其着色种子数目最多，为97粒，且染色时间较短，为18 h，其余条件是浸种温度20 ℃、浸种时间18 h、染色液浓度1.0%、染色温度35 ℃。

不过在试验中普遍存在的问题是茄子种子着色程度深浅不匀，有些种子着色太浅，不能清晰地观察种子胚各部分的染色情况；有些种子着色又太深，甚至全部被染成深褐色，也无法准确判断种子胚各部分的生活力情况。这可能与种子本身的生活力强弱程度、染色液浓度及染色时间等因素有关。

由于本试验为探索性工作，虽然得出的结论是在各种不同处理组合条件下最为理想的处理组合，有一定的说服力和科学性。但若想获得TTC法快速测定茄子种子生活力更加适宜的条件参数，还需要设计更多的影响因素处理组合，如增加不同浸种温度、时间组合，设计更多的染色液浓度梯度，增加更多的不同染色时间及染色温度的处理组合，并选用不同的茄子品种等，从而提高快速测定茄子种子生活力方法的可信度。

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