IFNα―2b对白血病K562细胞增殖及FAK mRNA表达的影响

【摘要】 目的：研究重组人干扰素（IFNα-2b）对人慢性粒细胞白血病急变期细胞系K562细胞增殖及黏着斑激酶（FAK） mRNA表达的影响。方法：应用MTT法检测IFNα-2K562细胞的抑制率，采用RT-PCR技术检测各IFNα-2b浓度组对K562细胞FAK mRNA表达水平的影响。结果：增加IFNα-2b浓度及延长反应时间，除48 h和72 h外，抑制K562细胞增殖的比率逐渐升高；IFNα-2b作用48 h，浓度1万U/mL对抑制细胞增长的比率最高；随着IFNα-2b浓度增加，K562细胞的FAK mRNA表达增高，其中1万U/mL IFNα-2b实验组FAK mRNA表达水平最高，各组比较差异均有统计学意义（P

【关键词】 IFNα-2b； K562细胞； FAK

Effects of Interferon α-2b on Cell Multiplication and FAK mRNA Expression in Leukemia K562 Cells/LIU Xiao-li，CHEN Ri-ling.//Medical Innovation of China，2016，13（17）：008-011

【Abstract】 Objective：To discuss recombinant human interferon （IFNα-2b） on human chronic myelogenous leukemia cell acute transformation phase cell line K562 cell proliferation and focal adhesion kinase （FAK） mRNA expression.Method：The inhibitory rate of IFNα-2b on K562 cells was detected by MTT method and the effect ofα-2b on the expression level of mRNA FAK in K562 cells was detected by RT-PCR technique.Result：In addition to 48 h and 72 h，the ratio of inhibiting K562 cell proliferation increased gradually by increasing IFNα-2b concentration and prolonging reaction time.IFNα-2b in 48 h and the concentration 10 thousands U/mL was the highest to inhibit cell growth.With the increase of the IFNα-2b concentration，FAK mRNA expression was increased by K562 cell，the highest expression level was experimental FAK mRNA of 10 thousands U/mL IFNα-2b，the differences were statistically significant of each groups（P

【Key words】 Interferonα-2b； K562 cells； Focal adhesion kinase

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.17.002

白血病是造血系统的恶性疾病，在青少年儿童恶性肿瘤中白血病死亡率高，严重威胁青少年儿童的身体健康。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，简称FAK）是在1992年发现的一个信号分子，因含有同整合素β亚单位结合的位点，与细胞的黏附密切相关。FAK在多种恶性肿瘤中异常表达，通过整合素/FAK/Src等信号通路参与肿瘤的血管生成，发展，转移侵袭等[1-4]。Bhatia等[5]发现，IFN（干扰素）可通过特异性地恢复整合素β1的黏附作用来增强慢性粒细胞白血病（CML）祖细胞对基质的黏附力，IFN可能通过调控整合素/FAK/Src信号通路抑制CML细胞增殖。本实验通过研究IFNα-2b对白血病K562细胞增殖和FAK mRNA表达的影响，探讨白血病治疗的新思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 K562细胞购于中科院上海细胞库，重组人IFNα-2b购于上海华新生物高技术有限公司，MTT购于Sigma USA，FAK内参上下游引物由上海生物工程公司设计及合成。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测IFNα-2b对细胞的抑制率 白血病K562细胞的浓度设为1×104/mL，阴性对照组（含细胞的RPMI-1640培养液）加入含细胞的RPMI-1640培养液90 μL和10μL PBS，各实验组（不同IFNα-2b浓度的含细胞培养液）分别加入10 μL终浓度为0.25、0.5、1、2、4万U/mL IFNα-2b。培养12、24、36、48、72 h后，取MTT溶液（5 mg/mL）

10 μL加入，混匀，孵育4 h（37 ℃，5% CO2），加入含SDS、异丁醇及10M HCl的细胞裂解液100 μL，

孵育12～20 h（37 ℃），丹尼酶标仪检测各组吸光度（波长设570 nm）。计算公式：抑制率=1-（实验组吸光度-空白组吸光度）/（阴性组吸光度-空白组吸光度）×100%。

1.2.2 IFNα-2b对白血病K562细胞FAK mRNA表达的影响 RT-PCR分别测阴性对照组、IFNα-2b终浓度为0.25、0.5、1、2万U /mL作用48 h FAK mRNA表达水平。实验步骤：（1）Trizol法抽提总RNA；（2）RNA样品浓度测定和质量鉴定；（3）设计及合成引物内参及FAK：由上海生物工程有限公司协助合成，从基因库中获得全基因序列，利用oligo v6.0软件设计引物。内参选择人GAPDH，上游引物：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游引物：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’FAK，扩增产物长度为143 bp；FAK上游引物：5’-GCTCCACCAAAGAAACCG-3’，下游引物：5’-GCCCGTCACATTCTCGTAC-3’，扩增产物长度为181 bp；（4）RT-PCR反应：按PrimeScriptR One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒说明书操作。采用图像分析软件BandScan 5.0分析电泳条带的光密度值，计算FAK与内参的光密度积分值比值（灰度比）作为FAK mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，样本均数的比较用单因素方差分析，根据方差齐性检验，当总体方差齐时选择LSD法；当方差不齐时，选择Tamhane’s T2法；用t检验进行样本均数的比较，以P

2 结果

2.1 各组IFNα-2b对K562细胞增殖抑制的影响 不同的浓度（0、0.25、0.5、1、2、4万U/mL）的IFNα-2b实验组与K562细胞反应12、24、36、48、72 h后，MTT法测定结果显示IFNα-2b体外对K562细胞的生长有明显的抑制作用。不同浓度的IFNα-2b作用于白血病K562细胞，不同的时间点，其抑制率不同。其中作用48 h时，抑制率最大，与12、24、36、72 h时间点比较差异均有统计学意义（P

浓度组比较，差异均有统计学意义（P

2、4万U/mL浓度组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 IFNα-2b对白血病K562细胞FAK mRNA表达的影响 RT-PCR结果显示：IFNα-2b 0万U/mL时，FAK/内参灰度比为（0.5067±0.0573）；IFNα-2b 0.25万U/mL时，FAK/内参灰度比为（0.5452±0.0546）；IFNα-2b 0.5万U/mL时，FAK/内参灰度比为（0.9344±0.1192）；IFNα-2b 1万U/mL时，FAK/内

参灰度比为（1.0652±0.1327）；IFNα-2b 2万U/mL

时，FAK/内参灰度比为（0.8188±0.0506）。

0.5、1、2万U/mL IFNα-2b组可上调K562细胞FAK mRNA表达水平，与对照组比较差异有统计学意义（P

0.5万U/mL浓度组；D为1万U/mL浓度组；E为2万U/mL浓度组

3 讨论

人黏着斑激酶（FAK）基因位于人体的第8号染色体上，cDNA全长4285 bp，蛋白质分子量为125 KD，编码1028个氨基酸，在生物进化过程中高度保守，各物种间的同源性高达90%。FAK的结构主要由N端FERM区、中心激酶区及C端区黏着斑靶向定位区域3个结构域组成，这些功能域都是FAK参与信号转导功能的关键部位。N端结构域含有同整合素β等信号转导蛋白结合的位点，区域内有389位氨基酸；激酶结构域指390～650位氨基酸区域，也叫催化功能域，可使PI3K、SRC、GRB2等蛋白的氨基酸残基磷酸化；C端结构域含651～1028位氨基酸，通过与目标蛋白的SH3结合介导蛋白质信号传导，含将FAK黏附到黏着斑（focal adhesion plaques，FAP）的功能域，称黏着斑定位区域（focal adhesion targeting，FAT）[6]。FAK可被磷酸化的酪氨酸位点分布在不同的功能域中，均是FAK发挥信号转导功能的关键部位，其中氨基端有Tyr397、Tyr407，激酶结构域有Tyr576、Tyr577，羧基端有Tyr861和Tyr925[7]。

FAK在细胞与细胞外基质及细胞间黏附中起关键作用，是一个多功能的非受体酪氨酸激酶，FAK通过酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸位点的磷酸化与含有SH2或SH3结构域的蛋白质结合，参与FAK/PI3K、FAK/Src、FAK/paxillin、FAK/JAK/FAK/Rho、Grb2CasPI-3K及STAT等多条信号转导通路，参加细胞分化、增殖、伸展和迁移及肿瘤的侵袭和转移等[8-13]。IFNα-2b对K562细胞的生长有明显的抑制作用。其中浓度为1万U/mL，作用为48 h，抑制率最大（P

IFNα-2b对K562细胞生长抑制及上调FAK mRNA表达的作用机制可能为：（1）FAK、整合素和Src形成黏着斑（FAs），加强细胞与细胞外基质接触，在肿瘤的侵袭浸润中起重要作用。Liu等[14]研究表明，下调FAK表达能促进肿瘤侵袭伪足形成，那么IFNα-2b可能通过上调FAK的正常表达，抑制肿瘤侵袭浸润从而达到抗白血病的作用；（2）可在多种细胞中自主表达的黏着斑相关非激酶（FAK related nonkinase，FRNK），是黏着斑激酶活性的负性调节区域，FRNK能抑制FAK参与黏着斑形成和FAK参与的信号转导途径[15]。IFNα-2b可能通过调控FRNK进而影响FAK参与黏着斑形成及FAK参与的信号转导途径。FAK可被磷酸化的氨基酸位点包括酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸位点，IFNα-2b是否通过抑制氨基酸位点的异常磷酸化及IFNα-2b是否通过调控FRNK增加FAK的正常表达，还有待于进一步探究。

参考文献

[1] Figel S，Gelman I H.Focal adhesion kinase controls prostate cancer progression via intrinsic kinase and scaffolding functions[J].Anticancer Agents Med Chem，2011，11（7）：607-616.

[2] Shang N，Arteaga M，Zaidi A，et al.FAK is required for c-Met/β-catenin-driven hepatocarcinogenesis[J].Hepatology，2015，61（1）：214-226.

[3] Heffler M，Golubovskaya V M，Dunn K M，et al.Focal adhesion kinase autophosphorylation inhibition decreases colon cancer cell growth and enhances the efficacy of chemotherapy[J].Cancer Biol Ther，2013，14（8）：761-772.

[4]成志勇，梁文同，颜晓燕，等.酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼对PTEN介导的K562细胞侵袭的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2012，28（11）：1129-1131.

[5] Bhatia R，Verfaillie C M.Inhibition of BCR/ABL expression with antisense oligodexynulleotides restores beta1 integrin-mediated adhesion and proliferation inhibition in chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitors[J].Blood，1998，91（9）：3414-3422.

[6] Sieg D J，Hauck C R，Ilic D，et al.FAK integrates growth factor and integrin signals to promote cell migration[J].Nat Cell Biol，2000，2（5）：249-256.

[7] Go?i G M，Epifano C，Boskovic J，et al.Phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate triggers activation of focal adhesion kinase by inducing clustering and conformational changes[J].Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（31）：E3177-E3186.

[8] Rustad K C，Wong V W，Gurtner G C，et al.The role of focal adhesion complexes in fibroblast mechanotransduction during scar formation[J].Differentiation，2013，86（3）：87-91.

[9] Golubovskaya V M.FAK and nanog cross talk with p53 in Cancer Stem Cells[J].Anticancer Agents Med Chem，2013，13（4）：576-580.

[10] Du T，Qu Y，Li J，et al.Maternal embryonic leucine zipper kinase enhances gastric cancer progression via the FAK/Paxillin pathway[J].Molecular Cancer，2014，13（13）：100.

[11] Quadri S K.Cross talk between focal adhesion kinase and cadherins：role in regulating endothelial barrier function[J].Microvasc Res，2012，83（1）：3-11.

[12] Fan H，Zhao X，Sun S，et al.Function of focal adhesion kinase scaffolding to mediate endophilin A2 phosphorylation promotes epithelial-mesenchymal transition and mammary cancer stem cell activities in vivo[J].J Biol Chem，2013，288（5）：3322-3333.

[13]张柯晴，吕坤聚，朱君祥.FAK、NF-κBp65及VEGF-C在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义[J].临床肺科杂志，2015，20（4）：603-606.

[14] Liu S，Yamashita H，Weidow B，et al.Laminin-332-beta1 integrin interactions negatively regulate invadopodia[J].J Cell Physiol，2010，223（1）：134-142.

[15] Cheng S Y，Sun G，Schlaepfer D D，et al.Grb2 promotes integrin-induced focal adhesion kinase （FAK） autophosphorylation and directs the phosphorylation of protein tyrosine phosphataseby the Src-FAK kinase complex[J].Mol Cell Biol，2014，34（3）：348-361.

（收稿日期：2015-11-19） （本文编辑：李颖）