利用安捷伦SamPIiQ SCX固相萃取柱和液相色普/串联质谱联用检测猪肉中的β2-激动剂

β2－激动剂是一种被广泛应用于猪肉生产中的非法生长促进剂，如果人们食用了高β2－激动剂残留的猪肉后，容易引发食物中毒，轻则出现肌肉震颤、头晕、呕吐等症状，重则危及生命，因此如何快速全面地检测猪肉中的β2－激动剂成为检测工作者亟待解决的问题。常用的β2－激动剂有特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗和福莫特罗，其常用的检测方法却无法对多种β2－激动剂同时进行检测。安捷伦公司近期开发并验证了一种同时检测四种β2－激动剂残留物的方法，该法主要采用了安捷伦公司新推出的固相萃取(SPE)产品对猪肉中的β2－激动剂进行提取和浓缩，并采用LC-Ms／MS(液相色谱／串联质谱联用)法对其进行分析。表1为四种β2－激动剂化合物的名称和结构。

实验方法试剂与药品

本实验中猪肉由本地市场采购。所有试剂都是质谱纯级，高效液相纯级或分析纯级。乙腈和水由Scharlau公司提供。乙酸乙酯、异丙醇由Fisher公司提供。标准物均采购自国家药品生物制品检定所(NICPBP)，以甲醇配制单个标准溶液(1.0mg／mL)，并在4℃下冷藏。以甲醇－水(10：90)配制合并工作溶液(10μg／mL)，并在4℃下冷藏。添加溶液应每周配制，以适当稀释合并工作溶液来制备。

设备与材料

安捷伦1200高效液相色谱系统，安捷伦6460三重四极杆液相色谱一质谱／质谱联用系统，安捷伦SamliQ SCX聚合物柱，50×3mL管，60mg(部件号：5982－3236)，安捷伦ZORBA×EcipsePlus C18色谱柱，50×2.1mm，1.8μm(部件号：959741-906)，安捷伦真空歧管处理盒(部件号：5982-9120)。

样品制备

液－液提取：于1.5mL带盖聚丙烯管中称取2g猪肉(精确至±0.01g)。加入8mL0.2M的乙酸钠(pH值5.2)溶液，并涡旋以混合均匀。然后加入β2－葡萄糖醛酸酶(1000U／mL)100μL，并涡旋混合2分钟。样品在37℃下水解16小时，水解产物经震动处理15分钟后，在离心机中用4000 rpm的速度离心分离10分钟。取4m上层清液至另一离心管中，加入5mL、0.1 M高氯酸溶液并调节pH值至1±0.3，再在离心机中以4000 rpm的速度离心分离10分钟。将上层清液移至另一试管中，用10M氢氧化钠溶液调节其pH值至11。

于样品试管中分别添加10mL饱和氯化钠溶液和异丙醇一乙酸乙酯(60：40)混合液，并震动处理5分钟。以4000 rpm离心分离5分钟后，将有机层仔细转移至另一离心管中。将异丙醇一乙酸乙酯混合液的添加、震动处理，离心分离和转移有机液层的过程重复两次，并将所有上清液合并。样品于40℃以氮气吹干，并将残留物复溶于5mL、0.2M的乙酸钠(pH值5.2)溶液中。该样品将用于固相萃取纯化。

固相萃取

固相萃取过程(SPE)如图1中所示。先用3mL甲醇活化安捷伦SampliQSCX柱，然后用3mL水平衡。取5mL样品溶液载入到柱中，并以重力通过色谱柱(约1 mL／min)。用2mL水和2mL、2％甲酸水溶液；中洗SPE／小柱，丢弃所有洗脱液。真空抽干SPE／小柱。最后以5mL、5％氨甲醇溶液洗脱，流速约为1mL／min。洗脱液于40℃氮气吹干，残留物复溶于1mL、0.1％甲酸的水／乙腈(90：10)溶液。样品经涡旋混合和超声波处理以完全溶解后转移至1.5mL离心管中，并在3000 rpm条件下处理5分钟。最后将样品转移至2mL的色谱小瓶中等待分析。

仪器条件

高效液相色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX EcllpsePlus C18色谱柱，50×2 1mm，1.8μm(部件号959741-906)，

流速0.4mL／mln；

柱温40℃：

进样体积：5μL：

流动相：水(0.1％甲酸溶液+2mM乙酸铵，A)；

乙腈(0.1％甲酸，B)；

梯度淋洗：

质谱条件

在正极模式下对4种化合物进行了监测。离子源条件如图2所示，多反应监测通道如表2中所示。

结果与讨论线性与检测限

实验中标准工作曲线(0.2b、0.5、1.0，2.0和5.0ng／g)是以添加适量混合工作溶液于空白基质来配制的。空白基体是通过将猪肉进行水解、液液萃取和固相萃取来制备的。校准曲线的结果如表3中所示。检测限(LOD)定义为每个化合物给出信噪比(S／N)大于3:1时的浓度。各化合物的检测限也列于表3中。

回收率与重现性

在猪肉中分别添加标样浓度为0.5、1.0、2.0ng／g，计算回收率和重现性。每个浓度重复分析6次。回收率和重现性数据列于表4中。添加猪肉萃取物(1.0ng／g)的色谱图如图3中所示。

结论

本实验开发并验证了一种同时检测四种β2－激动剂残留物(特布他林，沙丁胺醇、克仑特罗和福莫特罗)的方法。该方法为检测猪肉中四种β2－激动剂提供了亚nC／c水平的检测限(LOD)、以及0.25至5ng／g的动态校准范围。

结果表明，安捷伦SampliQ SCX可以作为在复杂基体中(如猪肉)，进行多种β2－激动剂的纯化和浓缩的有效方法。用标准添加基质所测定的回收率和重现性，符合猪肉中β2－激动剂残留物检测的中国国家标准。杂质以及基质效应是不会干扰任何目标化合物的定量，最低定量限明显低于最高残留限量。