糖多孢红霉菌红霉素高产菌种的诱变选育

摘要：目的诱变和筛选糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)红霉素的高产菌种。方法以糖多孢红霉菌L1为出发菌株，紫外线作为诱变剂，诱变和筛选生产所用菌种。结果获得了高产变株L226，其发酵水平较出发菌株提高了19.8％。结论此方法可有效地获得高产变株，发酵水平明显提高。

关键词：糖多孢红霉菌；高产变株；紫外线诱变

中图分类号：R978.1+5文献标识码：A文章编号：

1672979X(2009)07003503

利用液体发酵获得大量红霉素的技术已较成熟。诱变育种是提高菌种生产能力、提高产品质量、扩大品种和简化工艺的主要育种方法。以合适的诱变剂处理大量且分散的微生物细胞(一般处理孢子悬液)，在使绝大多数细胞致死的同时，使变异率大大提高，通过有效的筛选方法淘汰负变菌株，留用变异幅度最大的正变菌株。

1材料

1.1菌种

糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)L鲁南制药集团菌种选育中心提供。短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)CMCC(B)63202。

1.2培养基

斜面培养基(％)：淀粉1.0，玉米浆1.0，氯化钠0.3，硫酸铵0.3，碳酸钙0.5，灭菌前pH7.0。

摇瓶种子合成培养基(％)：蔗糖6.0，硝酸钾1.0，硫酸铵0.2，磷酸二氢钾0.3，MgSO4・7H2O0.12，蒸馏水配制，灭菌前pH6.4～6.8，118℃灭菌30min。

摇瓶发酵合成培养基(％)：蔗糖6.9，硝酸钾1.0，琥珀酸0.236，磷酸二氢钾0.27，MgSO4・7H2O0.10，ZnCl20.00104，MnCl2・4H2O0.00062，CuCl2・2H2O0.000053，CoCl20.000053，FeSO4・7H2O0.0025，CaCl2・2H2O0.00138，蒸馏水配制，灭菌前pH6.0～6.5，118℃灭菌30min。

1.3试剂

丙酸钠、氯化锂。

2方法

2.1菌种的紫外线诱变

糖多孢红霉菌L1作为出发菌株，用生理盐水15mL刮洗下培养好的新鲜斜面孢子，用玻璃珠打散，过滤，制得孢子悬浮液，取5mL于直径9cm培养皿中，加入回形针，置于磁力搅拌器上，在15W紫外灯下、距离30cm分别照射15，25和35s，稀释10－1～10－5，分别涂布于含1.5％丙酸钠(下层)和0.2％氯化锂(上层)的梯度平板上，恒温培养[2]。

2.2筛选方案

诱变处理后，变异细胞一般占存活细胞的百分之几或更低，而生产性状得到提高的细胞又占变异细胞中的很少部分，要寻找生产性状得到大幅度提高的个别细胞工作量非常大。为此，将筛选分为初筛和复筛两步。初筛的重点是分离培养尽可能多的菌株，复筛则以测定数据考察特性为主。初筛的菌株数越大，优良变异株漏选的几率越小。初筛时用预先设计制定的相同培养条件，尽快地将大量菌株筛完，数量是首要的，准确性是其次要求，1株菌株只做1次发酵。淘汰80％～90％的菌株后，复筛菌株量大大减少，生产性能相差较小，准确性的要求提高。因此，同一菌株应发酵3次，测定方法也应标准化，从而确定最优菌株[3]。

筛选的全过程可简述为：出发菌株(诱变处理)――单菌落(排除低产型)――菌落――大试管――摇瓶初筛――复筛――终筛――埋沙土。

2.3筛选培养基抗性选择

红霉素内酯环骨架由7个丙酸单元聚合而成，前体丙酸需经过丙酸激酶的催化作用参与红霉素的生物合成，而前体替代物丙醇可用作产生乙酰辅酶A羧化酶的诱导物，并通过甲酰基丙二酰辅酶合成红霉素内酯环，因此可通过筛选丙醇抗性突变株提高红霉素的生产能力[4]。紫外(UV)诱变过的存活孢子经氯化锂修饰，有修复提高突变“易出误差”的作用[5]。因此，通过UV诱变红霉素产生菌L并采用含有丙酸钠、氯化锂的梯度平板定向筛选耐丙酸钠的突变株。

2.4选育菌株效价鉴定

2.4.1斜面培养用接种环从沙土管或者新鲜的斜面挑取少量孢子在新配制的干燥斜面上划线，34℃培养7～10d。

2.4.2摇瓶培养采用二级培养，挖取新鲜斜面(1cm×1cm)接至装有80mL种子培养基的500mL摇瓶中，220r/min，34℃培养44～48h后，转至发酵瓶中培养，接种量5％，240r/min，34℃培养144h。

2.4.3效价测定用剂量管碟法测定生物效价[6]，检定菌为短小芽孢杆菌CMCC(B)63202。

3结果

经UV处理15，25，35s，经含有丙酸钠、氯化锂平板培养的平板中各挑选出100个菌株进行摇瓶实验，结果见表1。

由表1可见，UV与氯化锂复合处理红霉素产生菌效果明显，其最高正变率达到42％，效价提高15％的菌株较多。从中选出5株(编号分别为L216、L226、L253、L257、L299)进行摇瓶复筛，结果见表2。

由表2可见，L226的复筛结果效价较出发菌株提高了19.8％。进一步将高产变株L226与出发菌株L1进行丙酸钠和红霉素的耐受性实验，结果见表3。

由表3可见，高产变株L226对自身代谢产物红霉素及前体物丙酸钠的耐受性较对照菌L1明显提高。

4讨论

通过对高产变株L226的进一步摇瓶实验及发酵培养基优化，发酵水平较出发菌株提高了19.8％，效果较明显。

实验结果表明，UV诱变后，通过筛选对红霉素前体物和自身代谢产物耐受性强的菌株提高红霉素的发酵单位是可行的，工艺的进一步优化可使红霉素的发酵单位有较大提高，对提高生产能力有重要意义。

参考文献

[1]邹美云，朱卫民.红霉素链霉菌125菌株的特性研究[J].中国抗生素杂志，1989，14(3)：187191.

[2]刘峰，浦云，陈祥明.红霉素高产变株F157的选育及发酵工艺研究[J].福建师范大学学报(自然科学版)，2003，19(20)：6164.

[3]王岳，方金瑞.抗生索产生菌选育[M].北京：科学出版社，1988，177.

[4]孙艳，周仁清，吴琼.红霉素生物合成的生物化学和基因学[J].微生物学杂志，2005，25(2)：4549.

[5]熊宗贵，陈桂琴，袁杰利，等.红霉素链霉菌耐前体耐红霉素高产株的筛选[J]．沈阳药科大学学报，1985，2(4)：295297．

[6]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国国药典[M].2005年版二部.北京：化学工业出版社，2005：附录79.