超低温保存对贵州酥李种子生理生化特性的影响

摘 要：以贵州酥李种子为试验材料，探讨了超低温保存不同解冻方式对酥李种子生理生化特性的影响。结果表明，慢速解冻和快速解冻降低脱氢酶、α-淀粉酶、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性以及增加丙二醛（MDA）含量，而缓慢解冻中脱氢酶活性和丙二醛含量均无显著性变化，其余酶活性降低。因此，适宜酥李种子超低温保存程序为缓冻缓解。

关键词：酥李种子；超低温保存；生理生化指标

中图分类号： S662.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.001

酥李为贵州优良地方品种，目前主要以大田种植保存为主，但近年来，频繁受到自然灾害的影响，部分优良酥李单株逐渐消失。近些年发展起来的超低温保存为种质资源的长期保存提供了技术支持。目前，已广泛应用于柑橘[1]、铁皮石斛[2]、七叶树[3]、杏[4]、板栗[5]等种子的超低温保存。本试验以贵州酥李成熟种子为材料，研究超低温保存过程中不同解冻方式对其生理生化特性的影响，筛选出适宜的解冻方式，以期为酥李种子超低温保存技术程序的建立提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

试验材料为贵州酥李成熟种子，采自贵阳市。采后于室温下自然风干，测定含水量为10.85%。试验中选择10%二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂，以不经液氮处理的为对照（CK）。每个处理25粒，3次重复。

1.2 冷解冻程序

试验中冷冻方式均采用缓慢冷冻，解冻方式采用缓慢解冻、慢速解冻、快速解冻。具体参照陈礼光等[6]方法。

1.3 测定指标及方法

脱氢酶活性测定采用TTC染色法，α-淀粉酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法），丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法，过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性测定采用紫外分光光度法。

2 结果与分析

2.1 不同解冻方式对脱氢酶活性的影响

脱氢酶活性的强弱，与种子的呼吸作用强度、代谢能力强弱及种胚损伤程度有关。同时，还与种子的萌发呈正相关。由图1可知，采用缓解方式种胚的脱氢酶活性为34.46 μg·g-1·mL-1，从数值上看，甚至比对照种胚的脱氢酶活性（32.74 μg·g-1·mL-1）略高，与自然状态下种胚脱氢酶活性最接近，表明超低温保存后种胚的活力与自然状态下的种胚活力相似。采用慢解和快解方式种胚的脱氢酶活性与对照相比，均呈下降趋势。而种胚慢解与快解之间脱氢酶活性没有达到显著性差异，但都与对照达到了显著性差异，故不同处理方式对种子的脱氢酶活性产生了不同的影响。

2.2 不同解冻方式对α-淀粉酶活性的影响

α-淀粉酶在种子萌发生长过程中起着重要的作用，它将种子内贮藏大分子物质淀粉分解为可吸收利用的小分子物质，其活性的高低对种子萌发生长过程中的能量和各种中间产物的供应有很大影响。不同的解冻方式对种胚的α-淀粉酶的活性影响不同。分析图2种胚的α-淀粉酶活性，尤以采用快解方式的α-淀粉酶活性最低，为0.58 mg·g-1·min-1，降幅最大，对照种胚的α-淀粉酶活性为0.89 mg·g-1·min-1，几乎达到其1.5倍。缓解与慢解中的α-淀粉酶活性没有达到显著差异水平，但均与对照呈显著性差异。在不同的解冻方式中，α-淀粉酶活性大小为缓解>慢解>快解。

2.3 不同解冻方式对丙二醛（MDA）含量的影响

有关研究表明，在低温冷害条件下，活性氧自由基的积累超过阈值时，膜脂过氧化就会发生，反应中还会伴随着丙二醛的产生，丙二醛可与蛋白质结合使酶钝化，与核酸结合引起染色体变异[7]。因此，丙二醛的含量可以衡量种子的受损程度。试验表明，液氮保存对种子的膜结构也会产生不同程度的伤害。由图3可知，采用快解方式的种胚中丙二醛含量最高，达2.34 μmol·g-1，几乎为对照的3.5倍。说明此种解冻方式对种子的伤害非常严重，其次是慢解为0.69 μmol·g-1。而采用缓解方式的种胚丙二醛含量与对照无明显差别，可能此时种胚没有受到明显的损伤。对试验材料的伤害程度依次为快解>慢解>缓解。

2.4 不同解冻方式对抗氧化酶活性的影响

2.4.1 对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 SOD是植物体内清除自由基最重要的酶，一般来说，其活性大小能够作为反映细胞膜系统完整性的指标之一。对照中SOD的活性为160.53 U·g-1。从图4中可以看到，与对照相比，采用不同的解冻方式处理，种胚的SOD活性均有不同程度的下降。采用快速解冻处理后的种胚SOD活性均比其他2种处理方法低，为115.29 U·g-1，仅为对照的7/10，说明其胚细胞膜系统所受的低温伤害较严重，胚活力下降，其次是慢解，活性为134.75 U·g-1。同时，各解冻方式之间的SOD活性差异也很大，其大小依次为缓解>慢解>快解。

2.4.2 对过氧化物酶（POD）活性的影响 过氧化物酶是种子很重要的抗逆酶，早在20世纪初就已经用POD活性来衡量种子活力，高活力种子抗逆性酶活力强[7]。图5中种胚POD活性与对照中的POD活性491.63 U·g-1·min-1相比，不同解冻处理的种胚POD活性均呈下降趋势，尤以种胚快解的POD活性最低，为380.65 U·g-1·min-1。而缓解与慢解种胚的POD活性没有达到显著性差异，分别为431.71 U·g-1·min-1和419.96 U·g-1·min-1，但都与对照达到了显著性差异。

2.4.3 对过氧化氢酶（CAT）活性的影响 与SOD、POD一样，CAT也是细胞内重要的抗逆酶，可以清除细胞内多余的过氧化氢，减轻其对膜脂的伤害能力。由图6可知，各解冻方式对种胚CAT活性的影响不同。所有解冻处理中，采用快速解冻方式的CAT活性最低，为1.27 U·g-1·min-1，降幅最大，与对照及各处理间均达到了显著差异水平。采用缓解方式的CAT活性为2.40 U·g-1·min-1，慢解方式的CAT活性为2.27 U·g-1·min-1，两者之间并没有达到显著性差异。

3 讨 论

本试验通过对种子的酶活性及丙二醛含量等方面的测定，探讨了超低温保存对贵州酥李种子生理生化特性的影响。脱氢酶活性是检验种子活力的方法之一，脱氢酶活性的下降，导致种子萌发力的下降。缓解中脱氢酶活性比对照略高，说明超低温保存后的种子细胞还原能力提高，可能此时尚未对酥李种子造成严重的冷冻伤害。陈礼光等[8]的研究表明，在缓冻缓解方式下，能够提高锥栗离体胚脱氢酶活性。超低温保存对种子的某些性能具有一定的促进作用。在杉木种子[9]和南瓜种子[10]的保存研究中，超低温保存能够提高其萌发力，而本试验中缓慢冷冻方式种子的活力并没有提高，对于快速冷冻和慢速冷冻是否有助于酥李种子活力的提高，有待深入的探索。

在温度发生骤变时会影响到种子内部的生理活动，尤以硬实种子最明显，内果皮会炸裂，但是如果采取合理而有效的冷冻方式和解冻方式，并辅以冷冻保护剂的处理，便可有效地减小因为温度的急剧变化对种子造成的伤害，使种子保持较高的活力。有研究表明，闽粤栲离体胚超低温保存时采用冷冻保护剂为15%二甲亚砜+10%蔗糖+10%聚乙二醇的快冻快解组合方法最佳[6]。史锋厚等[11]认为超低温贮藏油松种子时以10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂，采用快速冷冻、慢速解冻的处理组合最佳。本试验发现缓解方式明显优于其他几种解冻方式，脱氢酶及SOD均比其他几种解冻方式种子的活性高，且用自然含水量的种子进行超低温保存，种子的萌发力未降低。在几种解冻方式中，不同解冻速度对保存效果影响不同，导致的低温伤害程度也不同，虽然抗氧化酶活性均有不同程度的下降，但是尤以快速解冻方法对种子的伤害最大，丙二醛含量最高。综合分析可知，适合自然含水量状态下酥李种子超低温保存的处理组合为缓冻缓解。

参考文献：

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[8] 陈礼光，郑郁善.锥栗种子离体胚超低温保存脱氢酶活性研究[J].福建林学院学报，2001，21（1）：32-35.

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[10] 蒋燕，郝文利，田野.液氮保存对南瓜种子生理生化特性的影响[J].北方园艺，2009（2）：77-79.

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