血塞通注射液对体外OGD/R损伤的BV2细胞炎症反应的影响

[摘要]该研究通过对小鼠神经小胶质细胞（BV2）体外模拟脑缺血再灌注（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）损伤探讨血塞通注射液（XST）抗炎症反应的作用及可能的作用机制。BV2细胞OGD损伤4 h后，通过测定细胞存活率（MTS法）确定复氧时间及血塞通给药浓度，采用ELISA法检测细胞上清中炎症因子TNFα，IL1β，IL6及IL10的分泌水平，蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测细胞中pERK，pJNK，pp38蛋白表达水平的变化，免疫荧光法检测NFκB p65的核转位水平。结果显示XST 25 mg・L-1可显著提高OGD 4 h/R 6 h引起的细胞活力的下降，并抑制TNFα，IL1β，IL6及IL10的分泌水平的增高，同时XST能下调OGD/R诱导的pJNK，pp38蛋白表达的升高，并逆转NFκB p65的核转位。以上研究结果表明 XST对OGD/R损伤的BV2细胞炎症反应具有显著的抑制作用，其作用机制可能与抑制前炎症因子的分泌，调节MAPK信号通路及核转录因子NFκB p65有关。

[关键词]血塞通注射液； 体外模拟脑缺血再灌注； 炎症因子； MAPK； NFκB p65

缺血性脑卒中是常见多发的神经系统性疾病，约占脑卒中的60%～80%[1]，是世界范围内危害人类健康的重要疾病之一。已有研究表明，小胶质细胞激活后的炎症反应和免疫应答参与介导缺血性脑卒中的脑损伤过程[2]。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）中参与免疫应答的主要细胞类型，约占所有神经胶质细胞的5%～20%[3]。激活的小胶质细胞通过分泌释放TNFα，IL1β，IL6，IL10等促炎因子以及NO，ROS等细胞毒性因子造成CNS神经元损伤[4]。血塞通注射液（Xuesaitong injection，XST）含三七总皂苷，三七长于止血、活血、消肿止痛，药理研究表明，三七有增加冠状动脉血流量、扩张血管、降低动脉血压、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、降低血黏度等作用。实验研究也表明，三七总皂苷制剂具有通利血脉、祛瘀化滞之功，能保护神经细胞，促进吞噬细胞的吞噬功能以及胶质细胞的修复功能，对脑梗死有确切的治疗作用[57]。本研究采用BV2细胞体外模拟脑缺血再灌注损伤，考察XST对体外OGD/R诱导BV2神经小胶质细胞炎症反应及相关的信号通路的影响，阐明XST抗炎的分子机制。

1材料

11细胞株BV2细胞购自中国科学院昆明动物研究所细胞库，细胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基加青霉素100 U・mL-1、链霉素100 mg・L-1，置37 ℃，5%CO2的培养箱内培养，每隔24 h换1 次培养液，48 h传代1次。

12药物与试剂血塞通注射液（XST，云南白药集团股份有限公司，批号XBl2002）；金纳多注射液（JND，批号H6138）；DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基及胎牛血清（Gibco公司）；青链霉素混合液（100×）（Biotopped公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；MTS试剂盒（Promega公司）；蛋白质提取试剂盒（QiaGen公司）；肿瘤坏死因子（TNFα）、炎症因子IL1β，IL6，IL10 ELISA试剂盒（eBioscience公司）；抗体：GAPDH Rabbit mAb，p38 MAPK Antibody，Phosphop38 MAPK （Thr180/Tyr182） Rabbit mAb，SAPK/JNK（56G8） Rabbit mAb，PhosphoSAPK/JNK （Thr183/Tyr185） Rabbit mAb，p44/42 MAPK （Erk1/2） Antibody，Phosphop44/42 MAPK （Erk1/2） （Thr202/Tyr204） Antibody，NFκB p65 Rabbit mAb，PhosphoNFκB p65（Ser536） Rabbit mAb（CST公司）。

13仪器CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司；Eppendorf 5810R型高速冷冻多用途离心机（德国）；缺氧小室购自加拿大Stemcell公司；微孔板检测系统Flex Station 3购自美国MD公司；ChemiDoc XRS系统购自美国Biorad公司；Leica DMI 4000B荧光倒置显微镜购于德国徕卡公司。

2方法

21体外模拟脑缺血再灌注（OGD/R）模型的建立体外模拟脑缺血再灌注（OGD/R）模型的建立参考文献方法并根据本实验结果略作改动[8]。细胞按一定密度接种于96孔板或6孔板中，培养24 h后，弃上清，用无糖、无血清的DMEM培养基更换，置于缺氧小室中，用95%氮气、5%CO2混合气体连续通气20 min，控制进气流量为20 L・min-1。随后，将出气阀夹紧并将小室置于37 ℃CO2培养箱中继续培养4 h。缺氧4 h后，氧糖剥夺试验结束，将细胞置于二氧化塘培养箱中常规培养（37 ℃，95%空气，5%CO2），复氧同时分别给予血塞通及金纳多注射液处理细胞，按照不同试验需要复氧培养一定时间。

22细胞活力测定将BV2细胞以15×104个/100 μL/孔的密度接种至96孔板中，OGD 4 h后加入不同浓度的血塞通注射液（625，125，25，50，100 mg・L-1），分别复氧15，3，6，12 h，复氧结束后，采用MTS试剂盒检测细胞活力，按说明书加入20 μL MTS，继续在培养箱中孵育4 h后，于490 nm处测定各组吸光度A490。

23酶联免疫吸附实验（ELISA）检测炎症因子表达将BV2细胞以15×104个/100 μL/孔的密度接种至96孔板中，按照OGD 4 h/R 6 h执行体外氧糖剥夺试验，复氧同时给药，复氧3 h后分别收集各组细胞上清液-80 ℃保存，按照ELISA试剂盒说明书测定各组细胞上清液中[瘤坏死因子（TNFα）、炎症因子IL1β，IL6和IL10水平。

24Western blot检测蛋白质水平将BV2细胞以10×106个/mL/孔的密度接种于6孔板中，按照OGD 4 h/R 6 h执行体外氧糖剥夺试验，复氧同时给药，复氧结束后收集各组细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，应用BCA法测定样品蛋白浓度。经SDSPAGE电泳后，电转蛋白至PVDF膜，封闭，分别加入1∶1 000稀释的兔抗小鼠的p38，Phosphop38 MAPK （Thr180/Tyr182），SAPK/JNK（56G8），PhosphoSAPK/JNK （Thr183/Tyr185），p44/42 MAPK （Erk1/2），Phosphop44/42 MAPK （Erk1/2） （Thr202/Tyr204）一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗兔二抗（1∶2 000）溶液室温孵育2 h后洗涤膜，ECL法显影，应用ChemiDoc XRS系统拍照，采用GelPro analyzer 4图像分析软件进行显影条带灰度值分析。

25免疫荧光检测NFκB p65核转位为检测BV2细胞NFκB p65在细胞中的定位，采用免疫荧光双标法检测OGD/R引起的NFκB p65核转位及药物的抑制作用。将BV2细胞以80×104个/100 μL/孔的密度接种于96孔板中，24 h后按照OGD 4 h/R 1 h执行氧糖剥脱试验，复氧同时分别给予50 mg・L-1血塞通及金纳多注射液处理细胞1 h。复氧结束后，用1×PBS轻轻洗细胞1次，每孔加入150 μL 4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，1×PBS洗细胞1次，每孔加入含03% Triton X100的1% BSA室温透化、封闭细胞1 h，1×PBS洗细胞1次，然后每孔加入100 μL兔抗小鼠NFκB p65一抗（1∶100稀释），37 ℃孵育2 h（或4 ℃过夜），1×PBS洗细胞3次，加入山羊抗兔IgGCFL 488二抗（1∶250稀释）37 ℃培养2 h，1×PBS洗细胞3次，加入终浓度为2 mg・L-1 Hoechst 33258染核，孵育10 min后1×PBS洗细胞1次，用Leica DMI 4000B荧光倒置显微镜检测NFκB p65在细胞质和细胞核中的表达，评价其转核情况及药物的抑制作用。

26统计学分析所有数据以±s表示，采用SPSS Statistics V170软件进行统计学处理，OneWay ANOVA分析比较各组均数之间的差异，以P

3结果

31XST对OGD/R损伤的BV2细胞的保护作用为了探讨XST对OGD/R损伤的BV2细胞的影响，本研究采用MTS法对不同条件处理后的BV2细胞活力进行了检测。为获得最佳的OGD/R条件及药物给药浓度，本试验对BV2细胞OGD时间，复氧时间及XST给药浓度进行了优化。结果显示，OGD 1～4 h后，A490明显降低，与正常组比较有显著性差异，以OGD 4 h细胞活力下降最低（P

与对照组相比1）P

缺血性脑卒中通过一系列复杂的病理生理事件导致脑损伤，而炎症反应已被证实为其中的一个关键因素[9]。缺血性脑卒中炎症反应的主要机制是激活小胶质细胞，从而进一步促进神经元的死亡，小胶质细胞被认为是存在于中枢神经系统中的一种特殊的巨噬细胞[10]。小胶质细胞过度活化是导致神经炎症介质（细胞因子和趋化因子）诱导的疾病进展的本质，能增强神经元损伤。血塞通注射液是从三七中提取有效活性成分而制成的注射液，主要含人参皂苷和三七皂苷，临床主要用于缓解脑梗死，动脉粥样硬化，脑栓塞，视网膜静脉阻塞等症状。此外，体外研究表明血塞通注射液能不同程度地抑制ADP和血管胶原诱导的人血小板聚集，其抗血小板聚集作用与拮抗血小板活化因子（PAF）有关[1112]。然而，血塞通注射液对脑缺血神经小胶质细胞激活引起的炎症反应有无影响一直未得到明确地阐明。 已有研究表明，激活神经小胶质细胞能引起其过度

增殖并向炎症部位迁移从而分泌大量的神经毒性物质及前炎症因子介导的神经损伤[1314]。小胶质细胞的激活能通过释放前炎症因子及细胞毒因子像IL1β，IL6，TNFα，MIP1a，NO，ROS等影响神经细胞的存活[1516]。因此，选择能够抑制OGD/R激活的胶质细胞炎症介质分泌的药物理论上能够改善神经细胞的存活。本研究通过OGD/R模型诱导的BV2细胞炎症反应，并对血塞通注射液抗炎反应进行考察，同时通过对炎症相关信号通路的检测揭示其抗炎症反应可能的作用机制。

为了获得对药物可靠的活性评价结果，本研究首先对氧糖剥脱模型缺氧及复氧时间进行了优化。结果显示BV2细胞在OGD 4 h/R 6 h后细胞活力明显降低（约45%），而复氧12 h由于细胞活力的自身恢复导致模型组与正常组之间细胞活力无显著性差异。同时25 mg・L-1XST能明显提高OGD/R诱导的细胞活力的下降，因此OGD 4 h/R 6 h条件可用于对药物活性的评价。利用此条件对XST进行量效关系考察，结果显示血塞通注射液提高细胞活力为非剂量依赖性，且在25 mg・L-1对OGD/R引起的细胞损伤具有最大的保护效应。此外，已有研究显示神经小胶质细胞衍生的炎症因子触发有害的下游信号通路的激活并促进神经细胞进一步的损伤，包括神经元功能的破坏及直接的神经毒性[17]。细胞活力结果显示血塞通注射液在25 mg・L-1能显著提高OGD/R引起的细胞活力的降低，因此，本实验通过检测细胞培养液中前炎症因子的水平来考察血塞通25 mg・L-1的抗炎活性。结果显示TNFα，IL1β，IL6，IL10水平在BV2细胞OGD/R后较基础水平（正常组）明显升高，25 mg・L-1血塞通能显著抑制炎症因子的分泌，减轻OGD/R引起的炎症反应，具有明显的抗炎活性。结合细胞活力和前炎症因子的结果，发现血塞通注射液能够提高细胞存活率，同时降低前炎症因子水平，提示血塞通注射液可能通过调节细胞存活及凋亡平衡而具有抗凋亡功能。因此，在后m的研究中更进一步的评价来揭示血塞通处理的受益是非常必须的。

M管上述研究已经证实血塞通具有明显的抗炎效应，但其作用机制仍没有得到充分地阐明。脑缺血后神经元的损伤通过氧化应激，炎症反应或线粒体功能失调最终激活凋亡级联反应。MAPK信号通路作为脑缺血损伤作用的靶点和介质的重要性已逐渐被认识。出现在脑缺血损伤后产生的氧化应激和炎症介质已被证实能够激活MAPK级联信号而参与神经元的存活和损伤[1820]。由于MAPK信号通路中包含许多重要的参与小胶质细胞分泌和调节炎症因子的信号分子，其可能在脑缺血疾病中代表了确切的病理学基础，对于OGD/R诱导的 MAPK信号通路研究具有重要意义[21]。为探讨血塞通注射液保护小胶质细胞免受OGD/R损伤的作用机制，本研究对OGD/R引起的BV2细胞MAPK信号通路的变化进行了检测，并考察血塞通注射液对MAPK蛋白磷酸化水平的影响。结果显示OGD/R能显著上调pERK1/2，pJNK1/2和pp38 MAPK 蛋白的表达，25 mg・L-1血塞通注射液能显著抑制JNK1/2和p38 MAPK的激活，而对pERK1/2蛋白表达的升高无抑制作用。提示JNK1/2和p38 MAPK信号通路可能参与血塞通的神经保护作用。

炎症反应已经被越来越认识到是脑卒中病理生理过程中重要的贡献者，炎症反应引起一系列细胞事件，如循环免疫细胞的渗透和脑居民免疫反应细胞的激活，包括小胶质细胞、星型胶质细胞和内皮细胞等[2223]。NFκB信号通路是这些免疫反应过程的中间调控者，参与诱导前致炎因子和趋化因子如IL1β，IL6，TNFα，iNOS的产生，进而在脑缺血状态下对神经元介导毒性效应[22]。本研究中OGD/R能显著诱导前致炎因子的分泌，提示NFκB信号通路可能参与OGD/R诱导的BV2细胞炎症反应过程，因此，本研究通过免疫荧光法检测NFκB p65转核情况来反应NFκB信号通路是否被激活，进而参与OGD/R诱导的炎症反应。结果显示，在正常组细胞中NFκB p65蛋白主要集中在细胞质表达，而经过氧糖剥脱及复氧后NFκB p65蛋白大部分在细胞核中高表达，提示OGD/R诱导了NFκB信号通路的活化。而给予血塞通注射液后，NFκB p65蛋白在细胞质和细胞核之间得到重新分配，并大部分重新转移至细胞质中，提示血塞通注射液对NFκB信号通路的激活具有显著地抑制作用。基于此研究结果，认为血塞通能通过抑制NFκB信号通路削弱OGD/R损伤诱导的炎症反应。

基于本次实验研究结果，血塞通注射液能够抑制OGD/R诱导的小胶质细胞激活并参与调控NFκB/MAPK信号通路的活化，减少前炎症因子的分泌而产生抗炎及保护神经元的作用。同时，血塞通注射液可能代表一种治疗方法，预防在缺血性疾病中小胶质细胞引起的损伤。进一步的研究需要在整体动物及原代神经元细胞基础上更深入地阐明血塞通注射液对缺血再灌注损伤的影响及可能的作用机制，为血塞通注射液在临床用于治疗中风偏瘫，淤血阻络动脉粥状硬化性血栓性脑梗死、脑血栓提供中药药理学基础。

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