平邑甜茶MhWRKY15基因cDNA克隆及其生物信息学分析

摘 要: 以平邑甜茶为材料，通过RT-PCR和RACE技术，获得平邑甜茶WRKY15基因的全长cDNA，命名为MhWRKY15（GenBank登陆号: GU576874）。生物信息学分析表明，该基因全长1 091 bp，包含810 bp的完整开放读码框，编码269个氨基酸，属于WRKY类转录因子的第II组，为WRKY15家族成员；其编码蛋白为可溶性蛋白，分子式为C1263H1941N365O425S12，相对分子量为29 423.2 ku，理论等电点为5.30；含有一个WRKY保守结构域，定位于细胞核，存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位点，其二级结构主要以无规则卷曲为主。

关键词: 平邑甜茶； WRKY15； cDNA； 生物信息学

中图分类号：S661．19 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－949－04

Cloning of MhWRKY15 gene in Malus hupehensis and its bioinformatics analysis

SUN Xiao-li， RAN Kun，YANG Hong-qiang*， LI Qiang， JIANG Qian-qian

（College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University・ State Key Laboratory of Crop Biology； 3Shandong Provincial Key Laboratory of Fruit Biology， Tai’an，Shandong 271018 China）

Abstract: Full-length cDNA sequence of WRKY15 gene from roots of Malus hupehensis （Pamp.） Rehd. var. pinyiensis Jiang， which was tentatively designated as MhWRKY15， with GenBank accession number GU576874， was acquired by RT-PCR and RACE with primers designed respectively based on the EST sequence. Bioinformatics analysis indicated that MhWRKY15 was 1 091 bp in length， containing an open reading frame of 810 bp and encoding 269 amino acids， and it belonged to group II of WRKY transcription factors and was one member of WRKY15 family. The results also showed that the protein encoded by MhWRKY15 was a soluble protein， with the molecular formula C1263H1941N365O425S12， the relative molecular weight was 29 423.2 ku and the isoelectric point was 5.30. There was one conserved WRKY domain in the protein sequence. The protein might be located in nucleus， and there were many phosphorylation sites， N glycosylation sites and O glycosylation sites. The predicted secondary structure demonstrated that random coil was the most important structural conformation.

Key words: Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.； WRKY15； cDNA； Bioinformatics

WRKY是植物特有的一种N端含有7个绝对保守的氨基酸序列（WRKYGQK）及锌指结构（CX4-7 CX22-23HXH/C）的转录因子[1-2]，它通过与核心序列为（T）（T）TGAC（T/C）的W-box顺式元件特异结合而调节基因表达[3-4]。目前，在拟南芥和水稻等植物中已克隆了大量WRKY成员[5-6]，根据WRKY结构域个数及锌指结构特征，这些成员可以分为3类。第Ⅰ类含有2个WRKY结构域；第Ⅱ类含有1个WRKY结构域，其锌指结构为C2H2型；第Ⅲ类含有1个WRKY结构域，其锌指结构为C2HC型[7]。WRKY明显受真菌、冷害、高温、干旱及盐胁迫等诱导，并参与胚胎形成、种皮及腺毛发育等多种过程[1-2，7]。平邑甜茶是苹果的优良砧木，克隆其转录因子并进行生物信息学分析，对于苹果砧木的分子调控及遗传改良有重要意义。

1 材料和方法

1.1 总RNA的提取及检测

取具4~6片真叶的平邑甜茶[Malus hupehensis （Pamp） Rehd. var Pinyiensis Jiang]，采用改进快速CTAB法提取根系总RNA[8]，琼脂糖凝胶电泳及Eppendorf核酸蛋白测定仪检测质量及浓度。

1.2 MhWRKY15基因的克隆

按照RNA PCR （AMV） Ver.3.0（TaKaRa）使用说明合成cDNA第1链，根据已知EST序列设计特异的上游引物P1: （5’-CAGATTATGAGCGACCAG GAG-3’）和下游引物P2: （5’-CGAGGAAACAAGTT GAAAG-3’），以cDNA为模板进行PCR扩增。产物回收后克隆入pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒后测序；根据测序结果设计3’-RACE上游引物P3: 5’-CATGGTGGTCCTGGAGT TCT-3’，下游引物为B26通用引物: 5’-GACTCGAG TCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT，扩增得到3’端序列。根据中间片段和3’端序列，设计5’-RACE上游引物P4（5’-CATTGCCCAGTGTAATCCT-3’）和下游引物P5（5’-CATCTTAACCCTCCTTTCT-3’），按照5’-Full RACE Kit（Takara Code: D315）使用说明，得到5’端序列。最后设计全长引物P6（5’-ATG GACCCCACATTCTTCAG-3’）和P7（5’-TCAACAGA ATCTGAGCTTGTG-3’），扩增得到MhWRKY15编码区序列。

1.3 生物信息学分析

用DNAStar软件中的EditSeq程序分析MhWRKY15全长序列，用ORF Finder （）、TMpred（www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html）、SignalP3.0（www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）、CELLO（cello. life. nctu. edu. tw/）、NetPhos 2.0（www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/）、NetNGlyc 1.0（www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/）和NetOGlyc 3.1（www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/）对编码蛋白进行保守域、氨基酸理化性质、跨膜区、信号肽分析、亚细胞定位、磷酸化位点、N-糖基化位点和O-糖基化位点分析。

2 结果与分析

2.1 平邑甜茶MhWRKY15基因cDNA全长序列的克隆

利用特异引物P1和P2，通过RT-PCR扩增得到长约350 bp的目的条带（图1-A），产物测序后确定为342 bp。通过RACE技术分别获得330 bp的5’端（图1-B）和741 bp的3’端（图1-C）序列。在拼接序列起始密码子和终止密码子处分别设计引物P6和P7，扩增得到810 bp的条带（图1-D），测序结果与拼接的编码区序列吻合。将该基因命名为MhWRKY15，GenBank登陆号为GU576874。

2.2 平邑甜茶MhWRKY15基因的核苷酸序列分析

EditSeq程序和ORF Finder分析显示，MhWRKY15全长1 091 bp，含有810 bp的完整ORF，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，包括134 bp的5’非翻译区（5’-UTR）和147 bp的3’非翻译区（3’-UTR），共编码269个氨基酸。

2.3 平邑甜茶MhWRKY15编码蛋白的系统发生分析

2.3.1 蛋白保守域分析 Conserved Domains Database蛋白保守域分析显示，MhWRKY15编码蛋白在80~140位氨基酸之间含有一个WRKY保守功能域，其中WRKYGQK为7个绝对保守的氨基酸残基；在该蛋白DNA结合域中具有一个C2H2型（C-X5-C-X23-H-X1-H）锌指结构，表明该蛋白属于第II组WRKY类转录因子；Blast分析确认该基因为WRKY15家族成员。

2.3.2 系统进化树分析 以最大简约法（MP）构建的多物种系统进化树（图2）显示，与平邑甜茶（GU576874）进化关系最近的是苹果（ADL36857.1），其次是大豆（ABS18444.1）和葡萄（XP002269267.1）。

2.4 平邑甜茶MhWRKY15编码蛋白的性质分析

ProtParam Tool分析显示MhWRKY15分子量为29 423.2 ku，分子式为C1263H1941N365O425S12，理论pI值为5.30，不稳定参数为52.50，属于不稳定蛋白。TMPred跨膜区域分析表明，该蛋白从内到外及从外到内的跨膜区域均为0；SignalP 3.0信号肽分析显示该蛋白没有信号肽。NetPhos 2.0分析表明该蛋白存在15个丝氨酸位点、2个苏氨酸位点和1个酪氨酸位点。NetNGlyc1.0分析显示在22、30、40及152位氨基酸处存在4个N-糖基化位点；NetOGlyc 3.1分析表明存在16个O-糖基化位点。CELLO亚细胞定位分析表明该蛋白定位于细胞核。SOPMA分析表明，该蛋白α-螺旋、延伸链和β-转角的比例分别为20.22%、11.61%和3.37%，无规则卷曲比例最高（64.79%）；用SWISS-MODEL构建的三维结构模型也显示MhWRKY15主要以无规则卷曲为主（图3）。

3 讨 论

转录因子是结合在目的基因特定DNA序列上的蛋白质，通过增强或抑制基因的转录效率来调控基因表达，真核生物基因表达调控主要是在转录水平进行。WRKY转录因子作为一种诱导型调节因子，参与植物的多种防卫反应、生长发育调节以及物质代谢调节等各种重要生理活动[3，7]。研究通过生物学信息学分析发现MhWRKY15编码蛋白存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位点，这表明磷酸化作用或糖基化作用能够调节MhWRKY15转录因子。蛋白磷酸化作用由蛋白激酶催化完成，是细胞信号转导过程中的作用环节；磷酸化位点的存在，表明MhWRKY15转录因子可受蛋白激酶调节，能够在细胞信号转导过程中发挥作用。事实上，WRKY通过与W-box元件发生特异性结合，可调节启动子中含有该元件的基因的表达，能够参与多种应答反应[2]。因此，MhWRKY15会在平邑甜茶转录调控、信号转导及对胁迫应答等中起调节作用。

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