干扰素调节因子8在骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多亚型中的表达研究

[摘要] 目的 研究干扰素调节因子8（interferon regulatory factor 8，IRF-8）在骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多（Myelodysplastic Syndromes with Excess Blasts，MDS-EB）亚型中是否存在表达异常，并分析其与MDS-EB的相P性。方法 收集三组共30例实验标本。其中20例为MDS-EB病例标本，分为MDS-EB1组和MDS-EB2组。10例为健康体检的健康对照组。30例标本均采集自受试者外周静脉血，采集后立即进行外周血总RNA提取，并经逆转录PCR后，以实时荧光定量PCR检测各标本的IRF-8 mRNA表达水平。各组平均表达量以RQ值（x±s）表示。 结果 三组样本实时荧光定量PCR的平均RQ值：MDS-EB1组（0.59±0.08），MDS-EB2组（0.26±0.10），健康对照组（1.20±0.26），三组表达水平存在显著差异（P

[关键词] 干扰素调节因子8；骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多；外周血RNA；逆转录PCR；实时荧光定量PCR

[中图分类号] R551.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）09-0043-05

Study on expression of interferon regulatory factor 8 in myelodysplastic syndromes with excess blasts subtype

XU Xudong1 XIAO Xiangyang1 CHEN Long1 WANG Jianchao2

1.Zhejiang Chinese Medicine University Second Clinical Medical College， Hangzhou 310053， China； 2.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To investigate whether the expression of interferon regulatory factor 8（IRF-8） is abnormal in myelodysplastic syndromes with excess blasts （MDS-EB） subtype and to analyze its correlation with MDS-EB. Methods A total of 30 experimental specimens from three groups were collected. 20 cases were MDS-EB case specimens and divided into MDS-EB1 group and MDS-EB2 group. 10 cases of healthy physical examination were as healthy control group. All the samples were collected from the peripheral venous blood of the subjects. The total RNA was extracted from the peripheral blood immediately after the collection. The expression level of IRF-8 mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR after reverse transcription PCR. The average expression of each group was expressed as RQ（x±s）. Results The mean RQ values of real-time fluorescent quantitative PCR in the three groups were MDS-EB1（0.59±0.08）， MDS-EB2（0.26±0.10）， healthy control（1.20±0.26）， and there was significant difference among the three groups（P

[Key words] Interferon regulatory factor 8； Myelodysplastic syndromes with excess Blasts； Peripheral blood RNA； Reverse transcription PCR； Real-time quantitative PCR

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一组源于髓系造血干细胞的克隆性疾病。根据WHO 2016年出版的诊断指南，MDS目前主要有8种亚型[1]，其中病情程度较为严重的亚型是骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多（MDS-EB）。MDS-EB占所有MDS亚型中发病的34.2%[2]。MDS-EB的骨髓原始细胞数目可达到5%～19%，根据MDS国际预后积分系统（IPSS）的评价，MDS-EB一般可划分为中危或高危，平均转白率接近40%[3]，其发病及转白过程中，可存在多种基因位点的突变和相关细胞因子的表达沉默，但其机制尚不明确。

干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）是一种具有抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫功能等多种功能的细胞因子[4]，IRF-8是其重要的家族成员之一，在肿瘤发病以及抗肿瘤相关免疫中具有重要作用[5，6]。在血液肿瘤方面，IRF-8表达缺失是慢性髓细胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）发病的重要分子事件，大多数CML患者的IRF-8 mRNA表达严重缺乏[7]。而同样作为血液肿瘤疾病的MDS-EB，目前还未有与IRF-8表达相关的研究报道。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2014年12月～2016年12月收集浙江中医药大学附属第二医院血液科住院的MDS-EB患者20例作为研究对象，并根据临床资料分为MDS-EB1组和MDS-EB2组。MDS-EB1组样本来自临床确诊的MDS-EB1患者，骨髓报告提示原始细胞数>5%且10%且

1.2方法

采用实时荧光定量PCR法测定外周血单个核细胞IRF-8 mRNA的表达水平。

1.2.1总RNA抽提 使用肝素抗凝管采集新鲜外周血，自然沉淀后收集上清液，1000 rpm离心15 min，分装上清，-80℃冻存。沉淀后的细胞部分以PBS洗涤，Ficoll分离外周血单个核细胞后，迅速进行总RNA抽提。

1.2.2 OD260/OD280 抽提总RNA后，取2 μL总RNA样品，测定260 nm、280 nm的吸光值，计算OD260/OD280，测定其纯度和浓度。

1.2.3 IRF-8的相对表达量 使用SYBR荧光染料试剂盒对样本进行定量分析，每个样本重复3次。引物由上海生工生物技术公司合成。IRF-8引物序列：上游引物5’-TTGTTGCCAGGAAGATTAG-3’，下游引物5’-CAAAGGAGAAAGGAGGACA-3’。计算机自动Ct分析法获得各个反应孔的Ct值，计算不同样本的平均Ct值，应用Ct法计算表达量。IRF-8用内参基因GAPDH进行校正，应用Step One Plus 2.2.3软件进行数据处理，根据公式2-Ct（RQ）计算IRF-8的相对表达量。

1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，再采用LSD-t检验行两两比较，P

2结果

2.1 总RNA提取浓度检测

对30个标本进行总RNA提取后进行浓度测定，各组平均浓度分别为MDS-EB1组（642±199）ng/μL，MDS-EB2组（495±110）ng/μL，健康φ兆椋514±88）ng/μL，具体数值见表3。各标本浓度符合进一步实验要求。

2.2实时荧光定量PCR结果

通过对三组样品进行实时荧光定量PCR检测，用内参基因GAPDH对结果进行校正。检测结果平均RQ值：MDS-EB1组（0.59±0.08），MDS-EB2组（0.26±0.10），健康对照组（1.20±0.26），具体数值及表达水平见表4和图1。

采用SPSS17.0统计软件对三组数据进行成对样本检验，三组实验样本间表达量存在显著差异（P

3讨论

迄今为止，对于MDS发病及其演变机制尚无明确定论，但一般认为骨髓免疫异常、基因水平改变、遗传学异常和细胞凋亡过度等是导致MDS骨髓造血干细胞克隆性病变的四大重要因素。近年来随着分子生物学技术的发展，对于MDS的分子诊断研究已经逐渐成为热点，在WHO最新出版的2016年MDS诊断指南中，提及了9种在MDS中80%～90%常见基因异常，包括SF3B1、TET2、SRSF2、ASXL1、DNMT3A、RUNX1、U2AF1、TP53和EZH2[1]。其中，SF3B1作为骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞增多（myelodysplastic syndrome with ring sideroblast，MDS-RS）非常重要的一个分子突变位点，对于疾病的诊治具有重要意义[8]。但另一方面，与其他血液肿瘤不同，目前临床上反应MDS疗效的生物标记物还非常有限[9]，尤其在MDS-EB这一亚型方面。

IRF-8是IFN-γ调控因子家族的成员，对于髓系细胞生成非常重要[10]，其作为IFN-γ/STAT1信号通路的关键分子，参与JAK/STAT的调控过程[11]，并介导Fas、Bax、FLIP、JAK1和STAT1的表达实现实体瘤细胞凋亡[12，13]。Watanabe T等[14]也在IRF-/-的小鼠实验中发现，IRF-8在调节髓细胞生成、发展分化及生长过程中起着重要的决定性作用。另外也证实了IRF-8在急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）、CML中的肿瘤抑制功能，恢复IRF-8的表达可拮抗Bcr/Abl的致瘤性作用[15]。

本研究将IRF-8运用到MDS-EB中，通过检测其mRNA的表达水平分析IRF-8的表达是否异常。实验结果显示相较于健康对照组，MDS-EB组的表达水平显著降低，表明IRF-8在MDS-EB发病过程中表达受到明显抑制，提示IRF-8可能是一种MDS-EB的抑制基因，对MDS-EB发病具有抑制作用。另外MDS-EB组间对比显示MDS-EB2中IRF-8的表达水平比MDS-EB1更低，这可能与IRF-8调节骨髓细胞生成、促进髓细胞分化成熟的作用有关[16]。因此IRF-8的表达抑制可能会造成骨髓细胞的成熟障碍，从而导致原始细胞数量增加，而原始细胞数量的增加与MDS-EB的发病和转白都具有密切关联，提示IRF-8的表达水平对于MDS-EB的疾病进展具有重要提示作用。

本研究中发现IRF-8在MDS-EB中表达存在抑制，而这种抑制可能涉及多种分子机制，并且与肿瘤的发病发展相关。在一些实体瘤中，异常甲基化是肿瘤发病的重要原因之一，实验研究表明，鼻咽癌和消化道肿瘤中，IRF-8启动子的异常甲基化会导致IRF-8表达抑制[17]，在肾细胞癌（RCC）中IRF-8作为功能性肿瘤抑制因子也经常发生甲基化[18]，而娄晔等[19]发现MDS-EB存在高甲基化状态，这可能与IRF-8的表达抑制相关。当然除甲基化外，组蛋白修饰等表观遗传机制也参与IRF-8的抑制表达。Banik等[20]研究发现IRF-8对组蛋白脱乙酰酶抑制剂的抗肿瘤活性具有重要作用，并且确认了IRF-8-MMP3新的肿瘤发病机制。Wonyong Lee等[21]研究表明甲基化试剂联合组蛋白脱乙酰酶抑制剂才能恢复IRF-8 mRNA水平的表达，这说明多种IRF-8的抑制机制可能存在多种控制中心。而在对IRF8-/-的小鼠模型恢复IRF-8表达能力后，证实IRF-8对AML和CML具有肿瘤抑制功能。因此，IRF-8对于MDS-EB也可能具有重要的抑制作用。

目前，一些肿瘤药物的开发研究主要用于抑制肿瘤细胞的增殖，从而达到缓解疾病的效果。如华蟾素就具有体内外抑制人胰腺癌细胞增殖作用[22]，而基于多信号通路报告基因对于这类药物抑制肿瘤进展的分子机制研究具有重要作用。IRF-8作为多种细胞信号通路当中的关键分子，其表达和抑制对于肿瘤进展及药物疗效都具有重要的提示意义。因此进一步研究IRF-8的分子机制不仅能对MDS-EB的靶向治疗奠定实验基础，还能对于华蟾素等肿瘤抑制药物在抑制肿瘤过程中的分子作用机制提供研究价值。

另一方面，在MDS-EB的发病机制上，除遗传学异常以外，骨髓免疫异常也被认为是MDS-EB发病的一个重要原因。而骨髓免疫异常也是免疫相关性全血细胞减少症（immuno-related pancytopenia，IRP）的主要发病原因。这两种疾病都具有骨髓造血异常、贫血等相似的临床症状，因此在临床鉴别上具有一定难度。IRP的发病机制一般认为与T淋巴细胞的调控异常有关，并伴有TH1、TH2、TH17阳性细胞比例异常[23，24]。而IRF-8在T淋巴细胞与B淋巴细胞的诱导分化上具有重要作用[25-28]，并且具有抑制Th17细胞分化的作用。所以，IRF-8不仅在MDS-EB中存在异常表达，也可能在IRP中也有异常表达，因此进一步研究IRF-8的作用与功能，对于这两种疾病发病机制的研究和鉴别均具有重要价值。

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（收稿日期：2017-02-05）