猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究

摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从有丝分裂原刀豆素（ＣｏｎＡ）诱导的长白猪外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因（ｍＰｏＩＦＮ－γ），并将其亚克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ中，构建重组表达载体ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ。经ＰＣＲ、酶切及测序鉴定后，转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）进行ＩＰＴＧ诱导表达，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，表明猪γ干扰素获得了高效表达，并具有免疫活性，表达产物约为２０．５ ｋＤａ，主要以包涵体形式存在，产物经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。利用细胞病变抑制法对其在Ｈ－ＰＲＲＳＶ／Ｍａｒｃ－１４５系统上进行抗病毒活性测定，结果表明其抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ活性为７．６８×１０３ Ｕ／ｍｇ。为进一步研究猪γ干扰素功能奠定了基础和理论依据。

关键词：猪γ干扰素；克隆；原核表达

中图分类号：Ｓ８５８；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2283-04

Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ

ＬＩＡＮＧ Ｗａｎｇ－ｗａｎｇ１，２，ＺＨＯＵ Ｄａｎ－ｎａ１，ＹＡＮＧ Ｋｅ－ｌｉ１，ＬＩＵ Ｚｅ－ｗｅｎ１，ＤＵＡＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｉｎｇ１，ＤＥＮＧ Ｊｕｎ－ｈｕａ１，

ＧＵＯ Ｒｕｉ１，ＹＵＡＮ Ｆａｎｇ－ｙａｎ１，ＸＵ Ｄｉ－ｐｉｎｇ１，ＴＩＡＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Hｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Vｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｕｂｅｉ Kｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ， ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ （ｍＰｏＩＦＮ－γ） ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｈｉｃｈ was ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｏｆ ＣｏｎＡ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｌａｎｄｒａｃｅ ｓｗｉｎｅ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ－２８ａ ｖｅｃｔｏｒ． Ａｆｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ． Ｔｈｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ２０．５ｋＤａ，was existed mainly in inclusion body． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｒｅｎａｔｕｒａｌｉｚｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＰｏＩＦＮ－γ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｈ－ＰＲＲＳＶ／Ｍａｒｃ－１４５ （ｖｉｒｕｓ／ｃｅｌｌ） ｔｅｓｔ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ＰｏＩＦＮ－γ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ－ＰＲＲＳＶ ｗａｓ ７．６８×１０３ Ｕ／ｍｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｏＩＦＮ－γ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ γ （ＰｏＩＦＮ－γ）； ｃｌｏｎｅ； ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

１９５７年Ｉｓｓａｃｓ和Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ从流感病毒感染的鸡胚细胞培养液中分离到一种生物活性物质，因其可干扰同源和异源病毒复制，故命名为干扰素（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＦＮ）［１］。现研究表明，干扰素是人或动物细胞受到病毒感染等刺激后，由淋巴细胞、巨噬细胞及体细胞等产生的一类细胞因子，不仅具有广谱抗病毒作用，还具有抗肿瘤和免疫调节等功能［２，３］。根据ＩＦＮ抗原性及分子结构差异，可将其分为３类：Ⅰ型干扰素，包括ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－τ和ＩＦＮ－δ等，主要起抗病毒作用；Ⅱ型干扰素，即ＩＦＮ－γ；新发现的Ⅲ型干扰素。

我国是养猪大国，猪病毒性传染病种类多、危害大，虽然目前我国普遍接种猪病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病。基因工程重组猪干扰素具有无副作用、无药物残留等优点，为新型兽药制剂。自２００６年以来高致病性蓝耳病在我国暴发，给养猪业带来了巨大损失，大量临床研究也表明，干扰素为有效治疗该病的首选药物之一。ＩＦＮ－γ又称免疫干扰素，主要由活化的Ｔ细胞和ＮＫ细胞产生，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能［２，４］。重组ＩＦＮ－γ对猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征以及猪水泡性口炎等病毒具有较好的抗病毒作用［５，６］，同时由于其免疫调节特性，可以增强疫苗的免疫效果，具有良好的应用前景。

该研究利用原核表达系统，在大肠杆菌中成功高效表达猪ＩＦＮ－γ，并初步研究了其对高致病性蓝耳病病毒（Ｈ－ＰＲＲＳＶ）的抗病毒活性，为进一步研究猪ＩＦＮ－γ的抗病毒作用以及免疫调节作用提供了依据和基础。

１材料与方法

１．１质粒、菌株和毒株

ｐＥＴ－２８ａ原核表达载体及宿主菌ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）均由动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存，高致病性蓝耳病病毒湖北分离株（ＨＢＫＭ２株）由该实验室分离和保存。

１．２试剂

猪淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ购自ＴａＫａＲａ和北京全式金公司；ＲＴ试剂盒、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶购自日本东洋纺ＴＯＹＯＢＯ公司；ＲＮＡ提取试剂盒、限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；鼠抗猪ＩＦＮ－γ单抗购自Ｓｅｒｏｔｅｃ公司；ＨＲＰ标记的兔抗鼠ＩｇＧ购自ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ公司。引物依据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的基因序列而设计，由上海生工生物工程有限公司合成。ＰＧＳ（扩增ｍＰｏＩＦＮ－γ成熟肽基因上游引物）：５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴ－３’（ＢａｍＨⅠ）；ＰＧＲ（扩增ｍＰｏＩＦＮ－γ成熟肽基因下游引物）：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣ－３’（Ｈｉｎｄ Ⅲ）。

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１．３淋巴细胞的分离、诱导及总ＲＮＡ的提取

前腔静脉采集长白猪新鲜抗凝血１ ｍＬ，与Ｈａｎｋ’ｓ液１∶１混匀后，小心加于２ ｍＬ的淋巴细胞分离液的液面上，以２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，小心吸取淋巴细胞层，用５倍体积的ＲＰＭＩ １６４０洗涤２次，每次洗涤后１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ。用含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ １６４０培养液稀释重悬至１×１０６个／ｍＬ，加入６孔板中，于５％ ＣＯ２培养箱中３７ ℃培养１２ ｈ，换液并加入终浓度为１５ μｇ／ｍＬ的ＣｏｎＡ，继续培养１２～２４ ｈ。收集淋巴细胞，按试剂盒说明书提取总ＲＮＡ。

１．４猪γ干扰素基因的扩增

按照逆转录试剂盒操作说明对淋巴细胞总ＲＮＡ进行反转录操作，利用高保真度的ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶和引物ＰＧＳ／ＰＧＲ扩增猪γ干扰素的成熟肽基因（ｍＰｏＩＦＮ－γ）片段，反应条件为９４ ℃ ３ ｍｉｎ，９４ ℃ ２０ ｓ，６０ ℃ ４０ ｓ， ６８ ℃ １ ｍｉｎ，３５个循环后，６８ ℃ １０ ｍｉｎ。

１．５重组表达质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ的构建

将ＰＣＲ产物用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收，用ＢａｍＨⅠ和Ｈｉｎｄ Ⅲ分别对ｍＰｏＩＦＮ－γ基因扩增片段和ｐＥＴ－２８ａ载体质粒进行双酶切、回收、连接构建重组质粒，命名为ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ。将连接产物转化ＤＨ５α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，进行ＰＣＲ、酶切鉴定和序列测定（由上海生工生物工程有限公司完成）。

１．６重组质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ的原核表达与检测

将重组质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ和表达载体ｐＥＴ－２８ａ分别转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取转化子于含有卡那霉素（终浓度为５０ μｇ／ｍＬ）的ＬＢ培养基中，３７ ℃、２２０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养至对数生长期（ＯＤ６００＝０．６～１．０）时，加入ＩＰＴＧ（终浓度为１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ）诱导表达３ｈ后，收集菌体，缓冲液重悬，进行超声波破碎，离心取上清和沉淀，按文献［７］所述的方法进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ所用的一抗为鼠抗猪ＩＦＮ－γ单抗，二抗为ＨＲＰ标记的兔抗鼠ＩｇＧ。

１．７重组猪γ干扰素（ｒＰｏＩＦＮ－γ）的纯化与复性

将包涵体沉淀以含８ mol/L尿素的缓冲液变性溶解，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ后，收集上清，按说明书进行镍柱纯化，洗脱液中加入适量复性液，装入透析袋，于４ ℃进行ＰＢＳ透析复性，期间更换透析缓冲液数次。复性后，采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行蛋白浓度测定，经０．２２ μｍ的滤膜过滤除菌后于－７０℃保存。

１．８重组猪γ干扰素的抗病毒活性测定

采用细胞病变抑制法测定重组ＰｏＩＦＮ－γ在Ｍａｒｃ－１４５细胞上抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ的活性。９６孔细胞培养板培养Ｍａｒｃ－１４５细胞至单层后，加入１００ μＬ ２倍倍比稀释的重组ＰｏＩＦＮ－γ，每一稀释度设８个重复，３７ ℃培养２４ ｈ后，弃上清，加入１００ μＬ １００ ＴＣＩＤ５０的Ｈ－ＰＲＲＳＶ，设只用重组ＰｏＩＦＮ－γ处理不接毒对照组、正常细胞对照组和只接毒阳性对照组。接毒９６ ｈ后观察细胞病变（ＣＰＥ）情况。采用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法计算重组ＰｏＩＦＮ－γ蛋白的活性单位。

２结果

２．１ｍＰｏＩＦＮ－γ基因的扩增

以ＣｏｎＡ诱导的长白猪外周血淋巴细胞的总ＲＮＡ为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因（即去信号肽基因）ｍＰｏＩＦＮ－γ，琼脂糖凝胶电泳结果表明扩增片段大小约为４３５ ｂｐ（图１），符合预期。

２．２重组质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ的酶切、测序鉴定

将构建的重组质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ用ＢａｍＨⅠ和ＢａｍＨⅠ／Ｈｉｎｄ Ⅲ分别进行单、双酶切鉴定，结果见图２。由图２可见，用ＢａｍＨⅠ单酶切可得到一条约５．８ ｋｂ的带，用ＢａｍＨⅠ／Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切则出现约５．３ ｋｂ的载体片段和约４３５ ｂｐ的外源片段（ｍＰｏＩＦＮ－γ）两条带。将重组质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定，测序结果进一步证明ｍＰｏＩＦＮ－γ的成功扩增，且重组表达质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ构建正确，未出现读码框“移码”和终止突变等现象。

２．３重组质粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ表达与检测

１５％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明（图３），含ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ重组质粒的Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１诱导后在约２０．５ｋＤａ处具有明显的表达带，大小与预期相符，而空载体转化的对照菌株在此处未见此条带。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析表明（图４），表达的重组猪γ干扰素（ｒＰｏＩＦＮ－γ）能够与抗猪ＩＦＮ－γ的单抗发生特异性的免疫反应，说明所克隆的ｍＰｏＩＦＮ－γ基因成功获得了表达，并具有良好的免疫反应活性。

２．４重组猪γ干扰素的抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ活性测定

表达的重组ＰｏＩＦＮ－γ包涵体蛋白经过柱纯化和复性后，测得蛋白浓度为０．１１ ｍｇ／ｍＬ。采用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法计算重组ＰｏＩＦＮ－γ蛋白的抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ活性单位，能抑制５０％ Ｍａｒｃ－１４５细胞发生ＣＰＥ的干扰素稀释度的对数ｌｏｇ２Ｘ＝距离比例+高于50%抑制病变比例的干扰素最高稀释度的对数=（81.8%-50.0%）/（81.8%-30.0%）+（-7）=-6.4，即将重组ＰｏＩＦＮ－γ稀释至２－６．４接１００ μＬ即可抑制５０％的细胞发生ＣＰＥ（表１），稀释度Ｘ即为重组ＰｏＩＦＮ－γ的效价，可计算出Ｘ＝２６．４ Ｕ／１００ μＬ，即表达的重组猪γ干扰素抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ／Ｍａｒｃ－１４５效价为８４４ Ｕ／ｍＬ，即７．６８×１０３ Ｕ／ｍｇ。

３讨论

ＩＦＮ－γ为Ⅱ型干扰素，与Ⅰ型干扰素一样，也具有抗病毒作用，但抗病毒性能不及Ⅰ型干扰素。由于ＩＦＮ－γ具有较强的免疫调节功能，主要表现在：（１）可诱导ＭＨＣ－Ⅰ类分子和ＭＨＣ－Ⅱ类分子的表达，从而提高抗原提呈能力；（２）参与辅Ｔ细胞的调节；（３）提高单核巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬能力。所以，ＩＦＮ－γ在机体对病毒感染的长期抵御过程中起着非常重要的作用，也是机体细胞免疫的重要检测指标之一，在疾病的诊断、预防和治疗方面具有极大的应用前景。

ＩＦＮ－γ基因在正常情况下处于关闭状态，当机体受到某些因素的刺激后方可表达，而且表达量低，故提取和纯化天然的ＩＦＮ－γ难度大、成本高。基因工程方法已成为ＩＦＮ－γ生产的主要手段，高产、低成本、低副作用等特点，使得重组ＩＦＮ－γ在临床上广泛应用。然而，相对人用干扰素，猪ＩＦＮ－γ的研究却滞后许多。

ＰｏＩＦＮ－γ基因含有３个内含子和４个外显子，所以我们用ＣｏｎＡ诱导猪外周血淋巴细胞，提取其总ＲＮＡ，进而通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出来。由于采用大肠杆菌表达系统，而外源蛋白的信号肽段会使表达的蛋白锚定在细胞膜上，从而严重影响表达量，所以扩增时我们去除了Ｎ端２３个氨基酸的信号肽序列，成功高效地表达了猪ＩＦＮ－γ的成熟肽基因。

此研究利用ｐＥＴ－２８ａ表达载体表达的重组ＰｏＩＦＮ－γ主要以包涵体形式存在，利用８ mol/L尿素对其进行变性溶解，由于重组蛋白携带有载体的Ｈｉｓ标签，故可采用镍柱进行纯化。纯化后的蛋白进一步采取透析复性方法进行蛋白的重折叠，使其恢复天然构象。通过对Ｈ－ＰＲＲＳＶ的抗病毒活性检测表明，复性的重组ＰｏＩＦＮ－γ具有较好的生物活性。

总之，该研究利用大肠杆菌表达系统成功表达ＰｏＩＦＮ－γ，并进行了提纯和复性，为进一步研究猪ＩＦＮ－γ的抗病毒、免疫增强和免疫佐剂功能奠定了基础，并且为进一步临床应用研究提供了前提。

参考文献：

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注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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