白藜芦醇对椎间盘髓核细胞产生IL―6和IL―8的影响

[摘要] 目的 探讨白藜芦醇对IL-1β诱导椎间盘髓核细胞产生IL-6和IL-8的影响。方法 原代培养椎间盘髓核细胞，并用5ng/mL IL-1β预孵育2 h。随后加入不同浓度的白藜芦醇孵育12～48 h。ELISA检测培养上清中IL-6和IL-8的产生。结果髓核细胞未经任何处理情况下，产生的IL-6和IL-8较低。IL-1β作用2 h后，IL-6和IL-8产生显著增多。而细胞随后用5 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L白藜芦醇处理后，IL-6和IL-8含量随着白藜芦醇浓度的递增而逐渐降低。5 ng/mL IL-1β作用12 h即可诱导较高水平的IL-6和IL-8表达。其峰值位于24 h。而采用50 μmol/L 白藜芦醇作用后，IL-8和IL-8水平明显低于IL-1β组。结论 白藜芦醇能抑制IL-1β诱导椎间盘髓核IL-6和IL-8的产生，从而可能发挥阻断炎性因子对颈椎体的破坏作用。

[关键词] 白藜芦醇；椎间盘突出；盘髓核细胞；细胞因子

[中图分类号] R9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（c）-0057-02

腰椎间盘突出是一种慢性退行性疾病，其确切病因和病理生理机制仍不清楚[1]。目前，炎症因素在椎间盘退变中的作用日益受到关注[2]。参与椎间盘突出的炎症介质有很多，包括IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2等[3]。IL-1β可以促使内皮细胞产生多种生物活性物质，还可以激活脑内的多种酶，如COX-2、iNOS等[4]。因此，以IL-1β作为炎症反应的诱导物，可广泛应用于各种细胞模型当中。该实验旨在探讨白藜芦醇对IL-1β诱导椎间盘细胞分泌细胞因子的影响，为研究椎间盘退行性病变的防治提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 主要实验试剂

白藜芦醇购自Sigma-Adrich公司（纯度>99%）。用DMSO配制成 0.2 mol/L 母液备用，使用前DMSO终浓度不高 0.1 %。IL-6和IL-8购自深圳欣博盛生物科技有限公司。IL-1β购自Sigma-Adrich。细胞培养板购自Corning。

1.2 髓核细胞的原代培养

将椎间盘手术患者术体内获取的椎间盘组织用D-Hanks液清洗，并将髓核组织与纤维环及纤维环交界区组织剪成1 mm3的小块， 反复洗涤后加入0.25%的胰蛋白酶消化15 min。离心洗涤后继续用0.2% II型胶原酶消化4 h。用完全培养基终止消化并用200目尼龙网过滤后，吹打成细胞悬液后接种于6孔板中，37℃、5% CO2条件下培养。

1.3 实验分组与处理

待髓核细胞生长至融合度为90%左右时，根据不同的实验目的分为组：①空白对照组：仅加入0.1% DMSO；②IL-1β组（阳性对照组）：加入5 ng/mL IL-1β作用2 h；③Res组：加入终浓度为5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L 3种浓度，按不同的实验目的分别作用 0 h、12 h、24 h、36或48 h。培养中止后收集细胞，进行测定。

1.4 ELISA检测IL-8和IL-6的产生

收集感染后24孔板中细胞上清液，按照ELASA 试剂盒说明书检测IL-8、IL-6的水平。即，100 μL细胞上清液加入到每个捕获抗体包被的微孔板中，室温孵育2 h。洗板后，加入100 μL检测抗体，室温继续孵育2 h。随后弃混合物，每孔加入100 μL streptavidin-HRP，室温避光孵育20 min。最后，每孔加入100 μL底物，室温避光孵育20 min，然后加入50 μL终止液，分光光度计检测450 nm处OD值。

1.5 统计方法

采用SPSS 15.0统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用one-way方差分析并行Student’s t检验。

2 结果

2.1 髓核细胞的分离与培养

人椎间盘髓核组织培养后4 h，细胞尚未完全贴壁，形态学表现为圆形，胞浆比例较大，细胞核清亮。继续培养5～7 d后，髓核细胞开始贴壁并转化为梭形原代细胞且呈单层生长。随后细胞间开始有突起相连接。15～20 d后融合成片。

2.2 不同浓度白藜芦醇对IL-1β诱导髓核细胞产生IL-6和IL-8的影响

髓核细胞未经任何处理情况下，产生的IL-6和IL-8较低。IL-1β作用2 h后，IL-6和IL-8产生显著增多。而细胞随后用5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L白藜芦醇处理后，IL-6和IL-8含量随着白藜芦醇浓度的递增而逐渐降低。见图1。

2.3 白藜芦醇不同时间对IL-1β诱导髓核细胞产生IL-6和IL-8的影响

髓核细胞用5 ng/mL IL-1β作用12 h即可诱导较高水平的IL-6和IL-8表达。其峰值位于24 h。而采用50 μmol/L 白藜芦醇作用后，IL-8和IL-8水平明显低于IL-1β组。见图2。

3 讨论

随着对炎性因子的深入研究，发现其不仅在导致疼痛的过程中发挥重要作用，而且还参与了椎间盘的退变。IL-6是一种具有许多生物学功能的细胞因子，对多种细胞的生长、化及基因表达都有影响，在椎间盘退行性病变中起重要作用[5]。研究显示，突出腰椎间盘组织培养液中IL-6含量远远高于正常椎间盘组织.腰椎间盘中的IL-6可能是通过自分泌或旁分泌方式产生，并作用于椎间盘自身细胞从而产生一系列病理效应。和IL-6一样，IL-8作为重要的白细胞趋化因子，对特异和非特异的免疫反应细胞具有强烈的趋化作用，并能调节细胞同血管内皮细胞的粘附和相互作用[6]。目前发现IL-8是多种原因所致的缺血再灌注损伤过程和全身性失控炎症反应的主要炎症因子，同时也可能参与椎间盘组织的退变[7]。

该实验的研究结果显示，单纯的髓核细胞本身分泌IL-6和IL-8不多。给予IL-1β刺激后，其含量显著增高。而给予白藜芦醇预处理后，髓核细胞中IL-6和IL-8含量随着白藜芦醇浓度的增高而明显降低，这表明白藜芦醇落能够抑制退变椎间盘组织中IL-6和IL-8的异常表达，对阻止颈椎间盘退变具有良好作用。白藜芦醇通过阻止退变颈椎间盘炎性因子的渗出，从而阻断了炎性因子对颈椎体的破坏作用，但究竟其影响机制如何，尚需进一步研究。

[参考文献]

[1] 杨文华. 老年性腰椎间盘突出特点及中西药结合治疗探析[J]. 当代医学， 2012，18（35）：152-153.

[2] 王娜， 赵丹慧， 田伟. 椎间盘突出症局部炎症机制研究进展[J]. 国外医学（骨科学分册）， 2005，26（4）：228-230.

[3] 项菁， 刘君， 黄拥军. 腰椎病突出椎间盘组织炎症因子含量与直腿抬高的相关性研究[J]. 中国医学创新， 2010，7（18）：18-19.

[4] 潘树和， 高云. 补肾壮督通络法对腰椎间盘突出症引起的自身免疫性炎症的作用[J]. 时珍国医国药， 2010，（12）：245-246.

[5] 尚琦松， 黄擘， 盛文辉， 等. 炎性因子TNF―α及IL-18与椎间盘退变的相关性研究[J]. 中国矫形外科杂志， 2009，17（5）：385-387.

[6] 史锐. 退变腰椎间盘组织中MMP-3、IL-1、TNF-α的表达变化及意义[J]. 山东医药， 2012，52（30）：67-68.

[7] 凯赛尔江・艾合买提， 拉莱・苏祖克， 曹鹏. IL-1β、TNF-α、VEGF在腰椎间盘突出组织中的表达[J]. 新疆医科大学学报， 2006，29（1）：38-40.

（收稿日期：2013-06-22）