Ang-1和Ang-2在大肠癌中的表达和临床病理特征的关系

[摘要] 目的：研究血管生成素1，2（Ang-1，Ang-2）蛋白在大肠癌组织中的表达及其与大肠癌临床病理特征的关系。方法：应用免疫组化法检测50例大肠癌患者及正常人大肠黏膜组织中Ang-1、Ang-2蛋白表达水平。结果：大肠癌组织中Ang-2蛋白表达阳性率为78%(39/50)，明显高于正常大肠黏膜组织的33.3%(5/15) (P0.05），Ang-2蛋白表达水平与患者性别、年龄及癌的体积、癌分化程度、淋巴结转移无关(P>0.05)，Dukes分期D期Ang-2蛋白表达水平明显高于A期（P

[关键词] 大肠癌；血管生成素1；血管生成素2；免疫组织化学

[中图分类号] R365，R735.3+4 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2007）12（c）-022-03

血管生成素是与血管新生密切相关的一类血管生长调节因子，该家族目前已发现四个成员:Ang-1，2，3，4。Ang-2和Ang-1可与血管内皮特异性的酪氨酸激酶受体(Tie-2)同一部位结合，Ang-2通过竞争性的抑制Ang-1的生物功能，降低血管的稳定性，继而导致高度不稳定性、不成熟性及高度内皮细胞增殖率的肿瘤血管持续生成。说明Ang-1和Ang-2表达的不平衡，可能在肿瘤的血管生成中起着至关重要的作用。

目前，已发现Ang-1和Ang-2在多种肿瘤组织中均有表达，本实验应用免疫组化技术对大肠癌组织及正常对照组织中的表达情况进行了检测，并分析结果，旨在探讨Ang-1和Ang-2在大肠癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1研究对象

选择临床及病理资料齐全的中国医科大学附属第二医院普通外科2001～2003年手术切除、病理证实为大肠癌的蜡块标本50例，全部病例术前均未行过化疗或放疗，病理均证实为腺癌。其中，男35例，女15例；年龄38～78岁，平均61.6岁；肿瘤的原发灶大小(D)、深度(T)、淋巴结转移(N)由病理确定，远处转移(M)由病理学和临床确定。组织学分型：高分化18例，中分化16例，低分化16例。局部淋巴结转移：无转移27例，有转移23例。血道转移：无转移34例，有转移16例。浸润深度： 浸润至肌层18例，浸润至浆膜(包括穿透浆膜) 32例。癌组织直径：

1.2主要试剂

PV-9000试剂盒及DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人Ang-1、Ang-2（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3主要仪器与器材

普通实验室冰箱、切片机、烤片机、高压锅、温育箱、温盒、恒温振荡器、OlympusBX41显微镜、显微数码照相机Olympus BX40F4等，均由中国医科大学附属第二医院病理科提供。

1.4实验方法

制片：每例取原发癌组织、对照正常组织及淋巴结组织，经10 %多聚甲醛固定，石蜡包埋，将蜡块制成5 μm厚的切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，置于60℃的烤箱内烤片72 h以上。常规HE染色，确定标本的组织分化程度。检测Ang-1 、Ang-2在大肠癌及正常黏膜组织中的表达。采用第二带通用型二步法测系统(PV-9000)免疫组织化学方法，具体操作步骤如下：①石蜡切片常规脱蜡水化：室温下二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡各10 min，无水乙醇浸泡5 min，95％、85％、75％梯度乙醇浸泡各5 min，水洗5 min。②阻断内源性过氧化物酶活性：3％H2O237℃温箱内孵育10 min，水洗。③抗原修复(高温高压法)：0.01mol/L pH9.0枸橼酸盐缓冲液浸泡，高温高压3 min，静置自然冷却至室温。④封闭非特异性位点：冲洗，滴加10％非免疫血清，37℃温箱内孵育10 min，静置自然冷却至室温。⑤孵育抗体；滴加一抗，4℃过夜；升至室温，冲洗，滴加生物素标记的二抗，37℃温箱内孵育30 min，冲洗，滴加SP复合物，37℃温箱内孵育30 min。⑥DAB显色：冲洗，DAB显色3～5 min；自来水冲洗。复染：苏木素复染5 min；自来水充分冲洗，0.1％盐酸酒精分化2～3 s；自来水冲洗，温水浸泡反蓝30 min。⑦脱水：75％、85％、95％梯度乙醇浸泡各5 min，无水乙醇浸泡5 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡各10 min。⑧中性树胶封片。对照用已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.5结果判定

Ang-1、Ang-2的阳性标准：胞浆或胞膜着棕黄、棕褐色颗粒为阳性细胞染色程度：基本不着色者为0分；着色淡者为1分；着色适中者为2分；着色深者为3分。染色细胞百分比：着色细胞占计数细胞

1.6统计学分析

对所有统计资料都采用SPSS13.0软件包进行统计分析。Ang-1、Ang-2为计数资料，各个相关因素的差异性比较采用χ2检查。各检查方法皆以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大肠癌组织及正常的大肠黏膜组织中Ang-1和Ang-2的表达

Ang-1和Ang-2蛋白染色阳性反应信号呈棕黄色细小颗粒，于癌细胞及血管内皮细胞质内高表达(图1，2)。

大肠癌组织Ang-2蛋白表达阳性率78%(39/50)，大肠黏膜正常组织Ang-2蛋白表达阳性率33.3%(5/15)。结果表明，Ang-2 蛋白在大肠癌组织中表达较正常组织高，两者差异有统计学意义(P0.05)，见表1。

2.2 Ang-2蛋白表达与大肠癌临床特征的关系

Ang-2蛋白表达水平与患者性别、年龄、癌的体积、组织分化程度、淋巴结转移无关，与癌的肠壁浸润深度、血道转移及临床分期相关，见表2。

3 讨论

大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中肿瘤的侵袭和转移是患者的主要死因。侵袭和转移是肿瘤细胞和宿主组织之间相互作用的一个复杂的多步骤的过程，该过程与肿瘤细胞的黏附力、运动能力、增殖能力、对周围间质的蛋白水解能力以及肿瘤组织内肿瘤性血管生成能力有关[1]。

血管生成素家族是近年来发现的一个既含受体激动剂又含受体抑制剂的促血管生成家族，目前，对Ang-1、Ang-2的研究较深入，研究认为，Ang-1的表达与肿瘤血管形成的多少关系不大，Ang-1具有促进血管稳定生长，促使内皮细胞移行的作用，主要促进血管腔的形成；但对内皮细胞分裂的作用很弱，部分实体肿瘤细胞也见表达[2]，而研究表明，Ang-2 参与多种肿瘤血管的新生，且与肿瘤血管形成的数目、肿瘤的临床分期及预后密切相关[3]。

我们应用免疫组化技术对50 例大肠癌组织及大肠黏膜正常组织中Ang-1和Ang-2蛋白表达情况进行了检测，结果表明，Ang-2在大肠癌组织呈现过表达，与正常组织相比，具有显著性差异(P0.05)，提示Ang-1与肿瘤血管的发生关系不大。促血管生成素家族是一类新型的血管生成调节剂，其在肿瘤血管生成中的地位，仅近年才有所涉及。本研究目的是分析大肠腺癌及癌旁正常组织中促血管生成素家族，特别是Ang-1、Ang-2的表达，探讨其在大肠癌血管生成及转移中的作用。结果提示，Ang-1和Ang-2在大肠腺癌及邻近的正常组织中均有表达，但是存在明显不平衡：在腺癌组织中，Ang-2的表达明显超过Ang-1的表达。有研究表明，Ang-1具有促进血管稳定生长，促使内皮细胞移行，主要作用于血管腔的形成；但对内皮细胞分裂的作用很弱，部分实体肿瘤细胞也见表达；Ahmad等[4]用Ang-1和Ang-2分别转染HT29直肠癌细胞，建立了小鼠移植瘤模型。结果显示，Ang-2和Ang-1对肿瘤生长和血管密度的影响完全相反，有研究表明Ang-2/Ang-1的比值可能是决定肿瘤性血管生成和肿瘤生长的最终因素。体内实验表明，Ang-2与Ang-1的血管生成缺陷类似，提示Ang-2 和Ang-1竞争与Tie-2结合，但Ang-2不能引起受体磷酸化，从而阻断Ang-1/Tie-2的信号传导，使内皮细胞与血管周细胞分离，破坏血管的稳定性，诱导内皮细胞分裂、移位，使新生血管呈非出芽式生长[5]。这种方式生长血管壁基质稀少，周边细胞样细胞缺如，胶原排列紊乱。为了探讨Ang-2蛋白表达在大肠癌演进中的作用，我们进一步分析了Ang-2蛋白表达与大肠癌各临床病理指标的关系。

总之，通过我们的研究，初步了解了Ang-1和 Ang-2在肿瘤发生和发展中的作用，构建Ang-1 和Ang-2的类似物，造成Ang-1和Ang-2表达的失衡，从而干扰肿瘤性血管的有效生成，可以抑制肿瘤的生长，开辟了一条治疗肿瘤的新途径。

[参考文献]

[1]李连弟，张思维，鲁凤珠，等.中国恶性肿瘤死亡谱及分类构成特征研究[J]. 中华肿瘤杂志，1997， 19(5)： 323-328.

[2]Koga K, Todaka T, Morioka M, et al. Expression of Angiopoietin-2 in human glioma cells and it s role for Angiogenesis[J]. Cancer Res ,2001, 61（16）: 6248-6254.

[3]Lafleur MA, Forsyth PA, Atkinson SJ, et al. Perivascular cells regulate endothelial membrane type-1 matrix metal lop roteinase activity[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 282: 463-473.

[4]Ahmad SA, Liu W, Jung YD, et al. The effects of angiopoietin-1 and -2 on tumor growth and angiogenesis in human colon cancer[J].Cancer Res, 2001, 61: 1255-1259.

[5]Stoeltzing O, Ahmad SA, Liu W, et al. Angiopoietin-1 inhibits tumour growth and ascites formation in a murine model of peritoneal carcinomatosis[J]. Br J Cancer, 2002, 87(10): 1182-1187.

(收稿日期：2007-11-12)

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