大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响实验研究

了解ADSCs的体外生长规律、生物学特性及成骨诱导分化能力的各种参数，已经成为目前急需解决的问题。本研究通过探讨ADSCs的生长增殖活性以及成骨分化能力，为ADSCs是否可以成为理想的种子细胞以及进一步基础研究和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象 健康SD大鼠，由辽宁医学院动物实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs分离及原代、传代培养

取SD大鼠，无菌条件下取腹股沟部脂肪组织，常规方法沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，置37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中常规培养。原代培养每3 d换液。待细胞生长达到80%时，进行1∶2传代，继续培养传代。

1.2.2 贴壁细胞鉴定

取第2代的ADSCs，按照试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，分为4份，分别滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。用SABC显色试剂盒显色，倒置显微镜下观察拍照。

1.3 成骨诱导培养及指标检测

取第3代细胞，分别以1×104/mL的密度接种于24孔培养板、5×104/mL的密度接种到放有盖玻片的6孔培养板中，更换为含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸的成骨诱导剂的DMEM培养基，每3 d换液。以加入不含诱导剂培养基的3代细胞作为对照组。

1.3.1 形态学观察

每日在显微镜下观察诱导后细胞的生长情况以及形态特点。

1.3.2 茜素红染色矿化结节计数

取成骨诱导21 d的细胞， 0.1%茜素红染色30 min，镜下观察照相。将每孔均分为4个象限，每个象限随机取一低倍2个视野，取8视野计数均值。

2 结果

2.1 贴壁细胞鉴定

对第2代贴壁细胞通过免疫细胞化学染色检测了CD34、CD44、CD49 d、CD106四个细胞表面标记，结果显示贴壁细胞CD44、CD49 d阳性表达，细胞胞浆呈现棕黄色；而CD34、CD106为阴性表达，大部分细胞胞浆未着色，细胞核蓝染。说明贴壁细胞为ADSCs，而非造血干细胞和BMSCs。

2.2 成骨能力检测结果

2.2.1 形态学观察

细胞在成骨诱导后，生长速度明显变慢，细胞形态变化相似，逐渐由梭形变为立方形、三角形、多角形，有数个突起。

2.2.2 矿化结节染色

成骨诱导21 d，细胞钙结节形成明显，经茜素红染色出现红色结节的阳性染色（图1），不加诱导剂的对照组染色为阴性（图2）。

3 讨论

本实验中从脂肪组织获取的单个核细胞，经过贴壁培养，贴壁细胞表面表达CD44、CD49 d阳性；而CD34、CD106为阴性表达。CD34作为造血干细胞标志性免疫表型，CD34阴性说明贴壁细胞并非来源于血液循环中的干细胞[1]，同时说明细胞未受到脂肪组织中微血管内皮细胞的污染；有研究显示ADSCs与BMSCs都可表达CD44[2]；CD49 d在ADSCs中为阳性表达，在BMSCs中则为阴性表达；而与CD106则相反；本实验CD106阴性表达，已经排除BMSCs污染的可能。以上结论说明已经得到纯度较高的ADSCs。CD49 d是调节造血干细胞和祖细胞定居归巢到骨髓的表面分子，CD106是调节造血干细胞和祖细胞从骨髓中向外迁移的表面分子，CD49 d与CD106是ADSCs与BMSCs很好的区别标记[3]，但其本质有待进一步的研究。

矿化结节是体外培养条件下成骨细胞鉴定的一个重要指标，也是直接反应干细胞成骨分化能力的一项指标。ADSCs诱导21 d后经茜素红钙结节染色，均出现红色结节的阳性表达。

参 考 文 献

[1] Civin CI， Banquerigo ML， Strauss LC， et al. Antigenic analysis of hematopoiesis. VI. Flow cytometric characterization of My-10-positive progenitor cells in normal human bone marrow. Exp Hematol，1987， 15（1）：10-17.

[2] Katz AJ， Tholpady A， Tholpady SS， et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal （hADAS） cells. Stem Cells， 2005， 23（3）：412-423.

[3] Gronthos S， Franklin DM， Leddy HA， et al. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol， 2001， 189（1）：54-63.