UTP23基因在A2780/Taxol细胞中表达及对紫杉醇化疗耐药的影响

[摘要] 目的 探讨上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞（A2780/Taxol）中UTP23基因表达水平及其对紫杉醇化疗耐药的影响。 方法 利用Real-Time PCR与Western blot分别从基因与蛋白表达水平检测A2780/Taxol 细胞中UTP23的表达水平，通过脂质体在A2780/Taxol 细胞异性瞬时过表达UTP23基因，利用MTT细胞增殖法观察过表达UTP23基因对A2780/Taxol 细胞药物敏感性的影响；通过Real-Time PCR检测A2780/Taxol 细胞过表达UTP23后抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平。 结果 A2780/Taxol中UTP23的mRNA表达水平降低，约为A2780细胞的50%，UTP23蛋白表达水平下降，约为A2780细胞的48%（P

[关键词] UTP23基因；紫杉醇；A2780/Taxol细胞；Bcl-2

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）08-0086-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of UTP23 gene in paclitaxel-resistant epithelial ovarian cancer cells（A2780/Taxol） and its effect on drug resistance of paclitaxel chemotherapy. Methods Real-Time PCR and Western blot were used to detect the expression level of UTP23 in A2780/Taxol cells from the level of gene and protein expression. The UTP23 gene was transiently over-expressed in A2780/Taxol cells via liposomes. The effect of the over-expressed UTP23 gene on the drug sensitivity of A2780/Taxol cells was observed by MTT cell proliferation method. The expression of anti-apoptotic gene Bcl-2 protein after over-expression of UTP23 gene in A2780/Taxol cells was detected by Real-Time PCR. Results The expression level of UTP23 mRNA in A2780/Taxol decreased，which was about 50% of A2780 cells. And the UTP23 protein expression level decreased，which was 48% in A2780 cells（P

[Key words] UTP23 gene； Paclitaxel； A2780/Taxol cells； Bcl-2

上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌，位居女性生殖系统癌症死亡率榜首，由于缺乏早期临床症状及特异的早期诊断标志物，大部分患者确诊时已是肿瘤晚期阶段，严重威胁着女性患者的生存[1]。目前，临床手术及术后紫杉醇等化疗药物的联合治疗，一部分患者初步有效，然而，大部分患者往往由于化疗药物耐药性的产生，最终死亡[2]。大量研究表明，逆转化疗药物耐药将有助于改善患者预后[3]。UTP23是一种核仁蛋白，与90S前核糖体颗粒相互连接，参与18S rRNA的A0、A1及A2早期位点修饰，核糖体是蛋白质合成的重要组成部分，rRNA直接调控蛋白合成的过程[4]。近年来，研究发现UTP23在多重耐药的肿瘤中呈现异常表达，并且与肿瘤的耐药密切相关[5]。本研究旨在探讨UTP23在上皮性卵巢癌耐紫杉醇细胞中的表达及其与耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养

上皮性卵巢癌细胞株A2780与上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol均购于中国科学院细胞库，均使用含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液，在37℃、5%CO2条件下恒温培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2 实验材料

胎牛血清购自Gibco公司，噻唑蓝（MTT）、RPMI1640培养液、紫杉醇均购自Sigma公司，BCA蛋白浓度测定盒购自碧云天生物技术公司，兔抗人UTP23抗体、兔抗人Bcl-2抗体、抗GAPDH抗体及相对应的二抗均购自美国Abcam公司，脂质体转染试剂、阴性对照转染试剂购自Santa Cruz公司，qRT-PCR试剂盒购自Takara公司。

1.3 RT-PCR测定UTP23基因表达

取对数生长期的A2780细胞与A2780/Taxol细胞，使用Trazol裂解液提取细胞总RNA，按照Takara公司提供的逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以GAPDH作为内参，进行UTP23基因扩增。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s 40个循环。应用2-ΔΔCt方法分别计算A2780细胞与A2780/Taxol细胞UTP23基因的相对表达量，重复3次实验。

1.4 Western blot蛋白印迹法测定UTP23蛋白表达水平

取对数生长期的A2780细胞与A2780/Taxol细胞，弃去细胞上清培养液，使用蛋白裂解液提取细胞蛋白后，BCA法进行蛋白定量检测蛋白浓度，以相同的作蛋白上样总量，进行凝胶蛋白电泳，电泳后将蛋白转移至预处理的硝酸纤维素膜，用5%浓度的脱脂牛奶封闭60 min，一抗孵育UTP23抗体（1∶100）、GAPDH抗体（1∶1000）4℃过夜。TBST溶液洗涤5次，每次3 min，加入相对应的二抗（1∶1000）室温孵育60 min。洗涤后加入化学发光液，进行曝光成像。

1.5 脂质体过表达UTP23基因与阴性对照

将A2780/Taxol细胞以3×105/孔接种于六孔板，含有10%胎牛血清完全培养液，在37℃、5%CO2恒温培养箱孵育至大约融合状态，参照脂质体转染试剂说明书，分别将阴性对照转染试剂及UTP23基因与脂质体混合后，加入A2780/Taxol细胞中，在37℃、5%CO2恒温箱继续孵育48 h。

1.6 MTT细胞增殖法观察UTP23基因对A2780/Taxol细胞耐药的影响

空白对照组（A2780/Taxol细胞）、阴性转染组（阴性转染A2780/Taxol细胞）与UTP23过表达组（过表达UTP23 基因A2780/Taxol细胞），以相同的细胞密度接种于96孔板，每组五个复孔，于37℃、5%CO2恒温培养24 h。分别加入紫杉醇（分别加入10、50、250、1250 nmol/L），继续培养48 h后，加入5 mg/mL的MTT培养液恒温孵育6 h，吸取上层细胞培养液弃去，加入100 μL DMSO完全溶解结晶，570 nm波长处测定吸光度值（A）。

1.7 RT-PCR法检测UTP23基因对A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达的影响

提取空白对照组、阴性转染组及过表达组细胞RNA，选取对数生长期A2780/Taxol细胞、阴性转染A2780/Taxol细胞与过表达UTP23 基因A2780/Taxol细胞，如方法1.3提取RNA、合成cDNA，进行Bcl-2基因扩增，以GAPDH作为内参，Bcl-2引物上游5’-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’下游5’- GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3’。实验条件为：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，进行40个循环。应用2-ΔΔCt方法分别计算三组细胞UTP23基因的相对表达量，重复3次实验。

1.8 统计学方法

应用SPSS 16.0统计学软件进行数据统计与分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P

2 结果

2.1 A2780/Taxol细胞中UTP23基因的mRNA表达水平

通过RT-PCR检测A2780/Taxol细胞与A2780细胞中UTP23基因的mRNA表达水平，结果显示，A2780/Taxol细胞中UTP23的mRNA表达水平显著减少，约为A2780细胞的50%，差异具有统计学意义（P

2.2 A2780/Taxol细胞中UTP23基因的蛋白表达水平

如图2所示，Western blot检测A2780/Taxol细胞与A2780细胞中UTP23基因的蛋白表达水平，如图2A所示，UTP23蛋白在A2780/Taxol细胞中表达水平显著下调，约为A2780细胞的48%，A2780/Taxol胞与A2780细胞UTP23蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义（P

2.3 A2780/Taxol细胞过表达UTP23基因

通过RT-PCR分别检测空白对照组、阴性转染组与UTP23过表达组的A2780/Taxol细胞UTP23基因mRNA表达水平，如图3所示，UTP23过表达的A2780/Taxol细胞UTP23 mRNA表达水平显著提高，约为阴性转染组的3.5倍，差异具有统计学意义（P0.05），说明UTP23基因过表达转染有效。

2.4 UTP23基因对A2780/Taxol细胞耐药的影响

通过MTT实验结果发现，UTP23基因过表达的A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性显著增加，相对于阴性D染A2780/Taxol细胞，当紫杉醇浓度为250 nmol/L时，UTP23基因过表达的A2780/Taxol细胞增殖受到抑制（P

2.5 UTP23基因对A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达的影响

通过RT-PCR检测UTP23基因对A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达水平的影响，如图5所示，与阴性转染组的A2780/Taxol细胞相比，UTP23基因过表达组的A2780/Taxol细胞Bcl-2基因的表达水平显著下降（P0.05）。

3 讨论

上皮性卵巢癌是女性三大生殖系统恶性肿瘤之一，死亡率占女性生殖系统肿瘤的第1位，虽然手术联合化疗的治疗水平提高，但由于肿瘤对化疗药物耐药性的产生，患者往往出现肿瘤复发，肿瘤远端转移，患者的5年生存率仅25%左右[6-9]。目前，临床紫杉醇是杀伤上皮性卵巢癌细胞的一线化疗药物，长时间应用，上皮性卵巢癌耐受紫杉醇，药物敏感度大大降低，严重影响治疗效果，是患者治疗过程死亡的最常见原因。但上皮性卵巢癌对紫杉醇耐药的关键分子与具体机制仍然不清楚。因此，如何逆转细胞耐药成为治疗上皮性卵巢癌的难点，得到人们的广泛关注[10]。

UTP23基因是新发现的一种小亚基组成部分，参与核糖体的成熟。早期研究显示UTP23可能参与肿瘤的发生发展，在结直肠癌中通过基因与环境的数据统计分析表达发现，位于8q23.3染色体的易感基因与UTP23表达高度相同的基因，与结直肠癌的发生密切相关[11]。近来，研究发现UTP23在上皮性卵巢癌化疗耐受患者癌组织表达显著低于化疗敏感患者，此外，UTP23低表达与患者的不良预后呈相关性，提示UTP23可能在上皮性卵巢癌产生耐药中发挥重要的作用，然而，其具体分子机制仍不清楚[12，13]。因此，本文选取上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞对UTP23基因表达及其在耐药中的作用进行探讨。

通过RT-PCR检测A2780细胞与A2780/Taxol细胞UTP23基因表达水平显示，A2780/Taxol细胞中UTP23基因呈现下调模式，Western blot从蛋白水平验证A2780/Taxol细胞中UTP23蛋白表达显著减少，分别从基因与蛋白水平验证UTP23在A2780/Taxol细胞表达减少，与早期报道一致，提示UTP23在上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞中可能参与耐药的产生。利用脂质体过表达UTP23基因后发现A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性显著提高，提示UTP23基因可促进紫杉醇对A2780/Taxol细胞的杀伤作用，减少耐药性。

研究报道卵巢癌耐药性产生有多种机制，不同化疗药物产生耐药性的具体机制亦不同。临床传统药物顺铂、阿霉素等主要通过促进多药耐药基因表达，从而导致卵巢癌产生耐药治疗失败；卵巢癌细胞中谷胱甘肽及其转移酶的表达增多，促进环磷酰胺及紫杉醇耐药性的产生[14-17]。此外，早期的研究在卵巢癌患者组织发现Bcl-2抗凋亡基因表达上调，与卵巢癌患者化疗药物耐受显著相关；Bcl-2是凋亡调控家族中重要的抗凋亡基因，主要通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞的不断生长，对药物产生耐药性[18-20]。本研究RT-PCR检测结果发现过表达UTP23基因后A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达水平显著下降，提示UTP23可能通过抑制A2780/Taxol细胞Bcl-2基因表达，从而抑制细胞增殖，增加A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性。

综上所述，本研究发现UTP23基因在A2780/Taxol细胞表达减少，过表达UTP23基因可下调Bcl-2抗凋亡基因表达，促进A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性，减少耐药性的产生，可部分逆转A2780/Taxol细胞对紫杉醇的耐药。UTP23基因调控A2780/Taxol细胞耐药的具体分子机制及胞内信号传导，有待更进一步研究。

[参考文献]

[1] Patel S，Kumar L，Singh N.Metformin and epithelial ovarian cancer therapeutics[J]. Cell Oncol（Dordr），2015，38（5）：365-375.

[2] Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2013，63（2）：11-30.

[3] Bookman MA，Brady MF，McGuire WP，et al.Evaluation of new platinum-based treatment regimens in advanced-stage ovarian cancer：A Phase Ⅲ Trial of the Gynecologic Cancer Intergroup[J]. J Clin Oncol，2009，27（5）：1419-1425.

[4] Li X，Pan QQ，Wan XY，et al.Methylation-associated Has-miR-9 deregulation in paclitaxel- resistant epithelial ovarian carcinoma[J].BMC Cancer，2015，15（1）：509.

[5] Timofeeva MN，Kinnersley B，Farrington SM，et al. Recurrent coding sequence variation explains only a small fraction of the genetic architecture of colorectal cancer[J].Sci Rep，2015，10（5）：16286.

[6] Piccart MJ，Bertelsen K，James K，et al.Randomized intergroup trial of cisplatin-paelitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer：Three-year results[J]. J Natl Cancer lnst，2000，92（5）：699008.

[7] Webber K，Friedlander M.Chemotherapy for epithelial ovarian，fallopian tube and primary peritoneal cancer[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2016，23（16）：30139-30140.

[8] Vallius T，Hynninen J，Auranen A，et al.Postoperative human epididymis protein 4 predicts primary therapy outcome in advanced epithelial ovarian cancer[J].Tumour Biol，2017，39（2）：89.

[9] Li H，Xiao N，Li Z，et al.Expression of inorganic pyrophosphatase（PPA1） correlates with poor prognosis of epithelial ovarian cancer[J]. Tohoku J Exp Med，2017，241（2）：165-173.

[10] Zhang SF，Wang XY，Fu ZQ，et al.TXNDC17 promotes paclitaxel resistance via inducing autophagy in ovarian cancer[J].Autophagy，2015，11（2）：225-238.

[11] Hutter CM，Chang-Claude J，Slattery ML，et al.Characterization of gene-environment interactions for colorectalcancer susceptibility loci[J].Cancer Res，2012，72（8）：2036-2044.

[12] Wang X，Wang SS，Zhou L，et al.A network-pathway based module identification for predicting the prognosis of ovarian cancer patients[J].J Ovarian Res，2016，9（1）：73.

[13] Wang X，Teng F，Kong LA，et al.PD-L1 expression in human cancers and its association with clinical outcomes[J].Onco Targets Ther，2016，12（9）：5023-5039.

[14] 李思瑾，丙忠.紫杉醇联合铂类化疗在上皮性卵巢癌的耐药研究[J].中华临床医师杂志，2013，7（22）：10231-10234.

[15] Januchowski R，Sterzyska K，Zaorska K，et al.Analysis of MDR genes expression and cross-resistance in eight drug resistant ovarian cancer cell lines[J].J Ovarian Res，2016，9（1）：65.

[16] Lopes-Coelho F，Gouveia-Fernandes S，Gonalves LG，et al.HNF1β drives glutathione （GSH） synthesis underlying intrinsic carboplatin resistance of ovarian clear cell carcinoma （OCCC）[J]. Tumour Biol，2016，37（4）：4813-4829.

[17] Ribeiro JR，Schorl C，Yano N，et al.HE4 promotes collateral resistance to cisplatin and paclitaxel in ovarian cancer cells[J].J Ovarian Res，2016，9（1）：28.

[18] Kim JH，Choi JS.Effect of ginsenoside Rh-2 via activation of caspase-3 and Bcl-2-insensitive pathway in ovarian cancer cells[J]. Physiol Res，2016，65（6）：1031-1037.

[19] Liu J，Liu J，Guo SY，et al.HSP70 inhibitor combined with cisplatin suppresses the cervical cancer proliferation in vitro and transplanted tumor growth：An experimental study[J].Asian Pac J Trop Med，2017，10（2）：184-188.

[20] Liang J，Yin K，Cao X，et al.Attenuation of Low Ambient Temperature-Induced Myocardial Hypertrophy by Atorvastatin via Promoting Bcl-2 Expression[J].Cell Physiol Biochem，2017，41（1）：286-295.