SPE-HPLC测定断血流片中醉鱼草皂苷Ⅳb的含量

【摘要】目的：建立固相萃取-高效液相色谱法测定断血流片中醉鱼草皂苷Ⅳb的含量。 方法：色谱柱Dikma Kromasil C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相甲醇水（80∶20），流速0.8 ml/min，检测波长250 nm，柱温40℃。 结果：醉鱼草皂苷Ⅳb在0.7715～6.136 μg范围内具有良好的线性关系（r＝0.9999），平均回收率为98.57％，RSD为0.56％（n＝9）。 结论：该方法简便、快速、有效、灵敏、准确，具有良好的重复性和回收率，可作为该制剂的定量分析方法。

【关键词】固相萃取法；高效液相色谱法；断血流片；醉鱼草皂苷Ⅳb；含量测定

文章编号：1009-5519（2007）17-2534-02 中图分类号：R9 文献标识码：A

Determination of the content of buddlejasaponins Ⅳb in duanxueliu tablet by HPLC

ZHANG Lei，HE Bing

(Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China)

【Abstract】Objective：To establish a method for the content determination of buddlejasaponins Ⅳb in duanxueliu tablet by solid phase extraction and HPLC． Methods：The separation was carried out on a Dikma Kromasil C18 column(5 μm，250 mm×4.6 mm)；The mobile phase was methanol-water（80∶20）；The flow rate was 0.8 ml/min；The detective wavelength was set at 250 nm；The column temperature was 40 ℃．Results：The calibration curve showed good linearity over the range of 0.7715～6.136μg（r＝0.9999）. The average recovery was 98.57％ with RSD 0.56％（n＝9）．Conclusion：This method was simple，rapid，efficient，sensitive and accurate,with good repeatability and recovery，it could be used as a quantitative analysis method for this preparation．

【Key words】SPE；HPLC；Duanxueliu Tablet；Buddlejasaponins Ⅳb；Content determination

断血流片是由断血流浸膏制成的片剂，具有凉血止血之功效。主要用于功能性子宫出血，月经过多，产后出血，子宫肌瘤出血，尿血，便血，吐血，咯血，鼻出血，单纯性紫癜，原发性血小板减少性紫癜等。本品收载于《中国药典》（2005版），其质量标准中含量测定采用液液萃取以除去杂质成分，但操作过程复杂费时。我们采用固相萃取法（SPE）纯化断血流片的样品液，再用高效液相色谱法（HPLC）法测定片中醉鱼草皂苷Ⅳb的含量。该方法比较简单快速，重现性好，具有良好的重复性和回收率，可用于改善该制剂的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器：戴安高效液相色谱仪（P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站）；HSE-12固相萃取装置（天津恒奥科技发展有限公司）；固相萃取小柱（Besep SPE Column，C18，500 mg/6 ml）；瑞士Precisa电子天平（XR 205SM-DR）；CQX25-06超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率250W，频率25 kHZ）。

1.2 对照品：醉鱼草皂苷Ⅳb（110782-200301），中国药品生物制品检定所提供。在选定色谱条件分离后按面积归一化法计算含量为98.36%，符合含量限度要求，故含量以100%计算。

1.3 试药：甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯水为重蒸馏水。

1.4 样品：断血流片，安庆乘风制药有限公司，批号：0504081，

0505102，0506181。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱Dikma Kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相甲醇水（80∶20），检测波长250 nm，柱温40℃，流速0.8 ml/min，进样量10 μl。

2.2 试液的制备

2.2.1 对照品溶液：取经五氧化二磷减压干燥至恒重的醉鱼草皂苷Ⅳb对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 ml含60 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液：取重量差异项下的本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％甲醇25 ml，超声10分钟，使其溶解，离心，过滤，并通过预处理好的C18小柱，用50％甲醇10 ml洗脱，弃去洗脱液，再用4 ml甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容到5 ml，摇匀，以0.45 μm的滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性对照溶液：取按处方比例及制备工艺制得不含断血流浸膏的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适应性试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。从图中可见，阴性对照在醉鱼草皂苷Ⅳb峰处无干扰，即本试验条件下醉鱼草皂苷Ⅳb与其它组份分离完全，与相邻色谱峰的分离度大于1.5，拖尾因子为0.99，理论塔板数以醉鱼草皂苷Ⅳb峰计为8620。

2.4 线性关系考察：分别精密吸取醉鱼草皂苷Ⅳb对照品贮备液（0.3086 mg/ml）2.5、5、10、15、20 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值A对进样量C（μg）进行回归，得回归方程：A＝38.9612C+0.0246，r＝0.9999。结果表明，醉鱼草皂苷Ⅳb在0.7715～6.136 μg范围内，峰面积值与进样量有良好的线性关系。

2.5 精密度试验：精密吸取“2.2.2”项下的同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样5次，记录醉鱼草皂苷Ⅳb的峰面积，其RSD为0.12％。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验：取“2.2.2”项下的供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24小时精密进样10 μl，记录醉鱼草皂苷Ⅳb的峰面积，其RSD为0.68％，表明供试品溶液在24小时内稳定。

2.7 重复性试验：取同一批样品，照“2.2.2”项下方法，制得5份供试品溶液，分别精密进样10 μl，记录醉鱼草皂苷Ⅳb的峰面积，其RSD为0.97％。表明本方法重现性良好。

2.8 加样回收试验：精密称取已知含量的本品细粉9份，每份约0.3 g，分成3组，每组3份，分别精密添加醉鱼草皂苷Ⅳb对照品贮备液（0.3086 mg/ml）2、3、4 ml，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，并计算回收率。结果见表1。试验结果表明，本法具有良好的回收率。

2.9 样品测定：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液10 μl，按上述色谱条件测定并计算醉鱼草皂苷Ⅳb的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 断血流制剂中，醉鱼草皂苷Ⅳb 的纯化方法，文献报道有采用液液萃取[1，2]，中性氧化铝[3]，大孔树脂[4]等，但各种方法操作过程均较复杂费时，损失较大，纯化效果也不是很理想，我们首次采用SPE纯化断血流片的提取，纯化效果比药典法及文献法更好。

3.2 本研究采用SPE-HPLC测定断血流片中主要有效成分醉鱼草皂苷Ⅳb的含量，结果准确可靠，精密度，重复性好，可用于改善该制剂质量控制。

参考文献：

[1] 国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[S]．北京：化学工业出版社，2005.608.

[2] 陈华国，陈 庆. HPLC法测定断血流中断血流皂苷的含量[J]. 贵阳中医学院学报，2006，28(3):62.

[3] 刘信顺，方晓明.HPLC法测定断血流制剂中风轮菜皂苷A的含量[J].中国药品标准，2001，2(1):32.

[4] 梁爱君，邓英贤. HPLC法测定断血流中断血流皂苷A的含量[J]. 药学学报，2006，22(3):217.

收稿日期：2007-04-24