免疫组化染色范文

免疫组化染色范文第1篇

【关键词】 儿童；幽门螺杆菌；免疫组化；检测；分析

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.34.014

Hp为消化性胃溃疡、胃炎及胃癌的主要致病原因之一。目前， 相关临床资料已经证实， 缺铁性贫血以及儿童生长发育较缓等均与儿童Hp之间存在相对紧密的联系， 因此， 采用何种方式提高Hp诊断准确率具有重要意义[1]。由此， 本研究针对儿童Hp免疫组化染色检测的价值进行分析， 现将结果报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 回顾性分析本院2013年12月～2014年12月收治的Hp感染患儿103例， 其中男女比例40：63， 年龄2～12岁， 平均年龄（7.48±1.56）岁；所有患儿在近1个月内均未接受抗生素或者抑酸制剂治疗。

1. 2 方法 所有患儿均予以免疫组化染色检测、CIM血清学检测、RUT试验以及13C-UBT试验。①RUT试验：所有患儿均予以电子胃镜（日本OLMPUS 260）检查， 于距离幽门5 cm处选取黏膜组织， 将此黏膜组织分成3块， 选取1块予以RUT实验， 严格按照说明书进行操作， 深紫色代表阳性， 未变色则为阴性[2]。②13C-UBT试验：口服13C尿素散剂（河北省协和药业有限公司生产）， 于服药前后30 min对呼出气体进行采集， 应用13C 红外光谱仪（北京华亘安邦科技有限公司）检测患儿呼出气体。③免疫组化染色检测：检测试剂均由福州迈新生物技术开发有限公司生产， 检测Hp中的抗原成分， 阳性为棕褐色。④CIM血清学检测：选用Hp快速检测试剂（上海安倍医疗器械贸易有限公司）， 利用免疫层析术对血清中Hp特异抗体进行检测。患儿需要保持空腹， 采取末梢血， 红色条带为阳性。

1. 3 观察指标 将13C-UBT试验检测结果作为黄金判定标准， 对本次检测结果进行判定：RUT试验、细菌培养、13C-UBT试验、单克隆的抗体粪便Hp抗原检测中一项阳性；Hp形态学、基因检测、免疫学两项阳性[3]。

1. 4 统计学方法 所有数据采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。 P

2 结果

2. 1 13C-UBT试验检测结果 经统计， 13C-UBT试验检测结果阳性62（60.19%）例， 阴性41（39.81%）例。

2. 2 三种检测结果对比 以13C-UBT试验检测结果作为黄金标准， 免疫组化染色检测共检出56（54.37%）例阳性， 敏感性、特异性、准确性分别为79.03%、82.93%、80.58%；RUT试验检出58（56.31%）例阳性， 敏感性、特异性、准确性分别为77.42%、75.61%、76.70%；CIM血清学检测共检出59（57.28%）例， 敏感性、特异性、准确性分别为88.71%、90.24%、89.32%。三组敏感性、特异性以及准确性比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

将胃黏膜标本通过石蜡包埋、乙醇固定以及切片染色进行处理的操作为组织切片染色， 将组织切片置于显微镜下进行观察， 其以Hp形态特点、分布特征作为诊断是否存在Hp感染的重要依据。临床研究证实， 采用组织学Hp进行诊断的同时可以进行病理学诊断， 其中W-S银染色法的效果尤为明显， 能够清晰地显示细菌， 但不足之处在于需要耗费较长的时间和一定的技术[4]。本研究方案将13C-UBT试验检测结果作为黄金判定标准， 发现其他三组检测结果的敏感性、特异性以及准确性之间无显著差异， 上述研究结果证实儿童Hp采用免疫组化法染色检测具有可行性。推测上述结果的产生可能与组织学免疫组化法染色检测不仅能够清晰观察黏膜表面、小凹腺腔中的Hp， 而且还能够对细胞内以及变形的Hp非菌体成分进行观察， 因而该方案检测在敏感性、特异性两方面均较强。本研究结果显示， 免疫组化法染色检查的检出率为54.37%， 阳性检出率接近于13C-UBT试验检测法， 可见该方案的Hp阳性检出率较高， 故可以作为一种可靠且稳定的检测方法。相关研究指出， 在检测胃癌或者低胃酸患者组织时， 受到其他相似细菌的影响， 可能导致误诊现象的存在， 因此更需要免疫组化染色进行辨认和诊断[5]。本研究中进行免疫组化染色采用的试剂均由福州迈新生物技术开发有限公司提供， 该试剂利于保存且能够多次使用。本研究结果中免疫组化法染色检测的敏感性相对较低， 考虑上述结果的产生可能与取材的部位以及取材的数量有关。

综上所述， 组织学免疫组化染色检测的准确性较高， 技术安全可靠， 且易于长期保存， 因此在儿童Hp的临床诊断中具有重要的应用价值。

参考文献

[1] 徐翠， 王涛， 周平.儿童幽门螺杆菌免疫组化染色检测分析.山东大学学报， 2014， 52（9）：82-84.

[2] 邹明艳， 张勇， 李锦霞， 等.儿童上消化道疾病的临床特征及与幽门螺杆菌感染的关系.实用医学杂志， 2013， 29（7）：1138-1139.

[3] 张运玲， 朱朝敏.儿童幽门螺杆菌感染的诊断与治疗.实用儿科临床杂志， 2012， 27（19）：1541-1544.

[4] 孙红霞， 张在亭， 宋建林， 等.现症感染条带检测对儿童幽门螺杆菌感染的诊断价值.山东医药， 2014， 54（37）：50-51.

[5] 沙莉， 朱东兵， 沈小建， 等.银染与免疫组化染色检测幽门螺杆菌的效果对比.诊断病理学杂志， 2013， 20（8）：509-510.

免疫组化染色范文第2篇

[关键词] 脱钙液；骨组织；免疫组化染色

[中图分类号] R446.4+1 [文献标识码] B [文章编号] 1673—9701（2012）24—0101—03

骨组织内含有大量无机钙盐，结缔组织坚硬，难以直接制片[1]。如果强制切片，在蓝色钙盐背景下，往往无法看清细胞结构，所以需要选择一种能保持骨组织形态结构和染色后有利于保持细胞结构清晰度和对比度的脱钙液。本文研究14%（体积分数）硝酸脱钙液、EDTA脱钙液、PLANK脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响，以期寻找一种效果比较理想的脱钙液，对病理诊断工作提供帮助。

1 材料与方法

1.1 标本选择

12例骨组织标本均来源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，在福尔马林中性液内固定24 h，用于脱钙及免疫组化染色实验。

1.2 三种脱钙液

①脱钙液Ⅰ：14%（体积分数）硝酸脱钙液，配制方法为14 mL浓硝酸加入86 mL蒸馏水；②脱钙液Ⅱ：EDTA脱钙液，配制方法为EDTA10 g，蒸馏水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，在用10 mol/L的HCl调pH为8.0，最后加入4%甲醛15 mL。③脱钙液Ⅲ：PLANK脱钙液，配制方法为氯化铝10 g，甲酸50 mL，10%福尔马林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸馏水至总体积100 mL。

1.3试剂和仪器

硝酸、盐酸、EDTA等化学试剂均购自广州化学试剂一厂，CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等抗体购自福建迈新公司，EnVision二步法试剂盒购自DAKO公司。切片机、染色机和切片刀购自英国shandan公司。

1.4 方法

1.4.1 脱钙处理 三组骨组织分别按以下方法进行脱钙处理：将12例骨组织标本平均分为A、B、C三组，并确定所选每份骨组织性质一样，分别将A、B、C组标本放入相对应的脱钙液中，间隔一定时间后更换脱钙液，以标本肉眼观察至半透明状，手感有弹性，大头针可顺利刺进骨组织，无砂粒感为脱钙完成，结合X射线确定脱钙终点。接着进行石蜡切片、免疫组化染色。

1.4.2 免疫组化染色步骤 骨组织固定、脱钙后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋及制成4 μm厚的连续切片，裱片后进行70℃烤片1 h，脱蜡至乙醇溶液，3%（体积分数）甲醇—H2O2封闭内源性过氧化酶10 min，高压锅枸橼酸缓冲液法修复2 min，加入Ⅰ抗，37℃孵育1 h，加入EnVisionⅡ抗，再于37℃孵育30 min，DAB显色1 min，苏木精复染（图像分析所用的切片未染色），脱水，透片，封片，光镜观察。

1.4.3 免疫组化染色结果判定 CD3阳性信号位于细胞膜、CD68阳性信号位于细胞浆、Ki—67和TTF—1阳性信号位于细胞核。于光镜下观察三种脱钙液脱钙骨组织免疫组化标记的结果，未复染的切片做图像定量分析，其方法为：将每种抗体免疫组化染色后的切片放在显微镜下，在同一组的每张切片相同的部位观察10个视野（4种抗体×10=40个视野），被测物质的各种信息通过摄像机将所测目标转换成数字图像，传递到计算机系统，标定组织片空白处入射光的光密度值（OD值），在监视器上用不同的分割方法和编辑功能，计算免疫组化染色阳性细胞平均OD值，其值代表了切片中相应抗原性的相对强度。

1.5 统计学分析

图像分析结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0作方差分析。

2 结果

2.1 不同脱钙液对骨组织脱钙时间及效果比较

2.1.1脱钙时间 14%硝酸脱钙液脱钙时间最短。14%硝酸脱钙液

2.1.2脱钙效果 14%硝酸脱钙液脱钙效果最好。14%硝酸脱钙液﹥PLANK脱钙液﹥EDTA脱钙液（表1）。

2.1.3对组织损伤 EDTA脱钙液对组织损伤最小。EDTA脱钙液

2.2 不同脱钙液脱钙对骨组织免疫组化染色结果比较

见表2 。三种脱钙液免疫组化染色图像结果用方差分析进行两两比较，其结果为硝酸脱钙液和PLANK、EDTA脱钙液比较有显著性差异，EDTA脱钙液和PLANK脱钙液比较无显著差异。硝酸脱钙液对组织损伤较大，切片颜色欠鲜艳，细胞核着色弱，组织结构欠清晰。PLANK和EDTA脱钙液脱钙效果较好，显微镜下观察组织结构完整、清晰，色泽鲜艳，对比度较好。

2.3 脱钙后免疫组化染色效果

见表2。见图1～3。

3 讨论

脱钙是指用化学或物理方法将骨组织中的钙盐和胶原纤维分离，除去钙盐，获得完整的胶质纤维成分[2]。骨组织含有大量的钙盐和无机盐，需经过脱钙处理，使组织软化后才能进行切片处理。常用的脱钙剂主要包括单纯酸类、混合酸类、螯合剂等。免疫组织化学对临床病理检查非常重要，因而应选择较好的脱钙液对所选骨组织标本进行较好的脱钙处理，且不破坏细胞和组织结构，形态清楚，进而确保免疫组化染色的效果较好并合适临床需要。

14%硝酸脱钙液是常用于临床脱钙液之一，具有脱钙能力最强、脱钙时间最短等优点。但是，对骨组织脱钙程度较难把握，容易造成过度脱钙现象；同时脱钙后易出现组织肿胀及细胞结构不完整清晰的不良现象。硝酸在脱钙过程产生CO2，气泡从组织中溢出将导致结缔组织分离。另一方面，硝酸对组织进行脱钙时还酸化组织，造成细胞核着色能力下降而返蓝困难进而变成淡红色，对比度差，由于亚硝酸形成使组织变黄而影响其后的染色[3]，在室温条件下更明显。硝酸在溶解骨组织钙盐时也对抗原物质具有破坏性，因而抗原免疫活性降低，免疫组化染色效果不佳[4]。结合本实验验证硝酸脱钙液脱钙后较易影响其后的免疫组化染色效果。

EDTA是科研中常用的脱钙剂，能够与羟基磷灰石结晶的外层钙结合，同时促进内层结合钙向外转移，进而溶解钙盐，是脱钙和免疫组化染色理想的脱钙剂[5]。本实验观察到EDTA脱钙液对骨组织脱钙效果较好，能保持完整的组织结构，且不破坏抗原物质，免疫组化染色阳性细胞数量多、着色深、背景淡。然而，在室温条件下，其脱钙时间过长，脱钙后组织稍微变硬，不太适合临床电镜快速诊断的要求，且其价格较贵，综合而言不利于临床检查工作。目前认为，应用微波技术可促进EDTA的螯合作用，缩短脱钙时间[6]。使用微波技术时应注意固定实验条件、调整微波功率和时间、温度也不能超过60℃等。

本研究表明，与硝酸、EDTA脱钙液比较，PLANK脱钙液具有常温脱钙时间较短、脱钙效果较好，免疫组化染色着色鲜艳、对比度佳、阳性细胞数多等优点。PLANK脱钙液[7]是一种氯化铝、甲酸、甲醛和冰乙酸组成的混合脱钙液，其中甲酸和溶液中的铝离子对组织影响较小，免疫组化染色效果优良。甲醛可加强对组织的固定并具有抗酸浸蚀的作用。冰乙酸能较好保持染色体结构，并能减少酸对细胞核的破坏。其配制成分中，通过增加甲酸的浓度并用冰乙酸辅助，可以加快脱钙速度。常温下PLANK脱钙液快速软化组织，对组织抗原损伤较少，细胞结构清晰完整，加之其脱钙时间较短、配制简单、经济等有利条件，较适合用于临床检查工作[8]。

CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等细胞因子多在肿瘤组织中表达，快速准确的病理诊断有利于患者的临床诊治。因而，选择合适的脱钙液成为重要工作环节之一。本实验通过比较14%硝酸脱钙液、EDTA脱钙液和PLANK脱钙液的脱钙和免疫组化染色效果，综合评价认为PLANK脱钙液较适合用于临床快速病理诊断。

[参考文献]

[1] 赵刚，杨海贤，白景文，等.不脱钙骨组织标本超薄切片的制作方法[J].临床与实验病理学杂志，2005，21（3）：36.

[2] 胥维勇，杨群.脱钙方法与脱钙液的选择及应用[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11（3）：263.

[3] 谢玲，邹丽宜，张志平，等.改良脱钙液制作脱钙骨石蜡切片与传统方法的比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（11）：2125—2128.

[4] Weisberg EC，Hilburn M，Johnson B，et al. Intraoperative Microwave processing of bone margins during resection of head and neck cancer[J].，Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2001，127（7）：790—793.

[5] 罗灿峤，莫木琼，钟觉民.不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用[J].中国实用医药，2011，6（19）：27—28.

[6] 刘大维，初同伟，张良，等.微波脱钙骨的免疫组化染色[J].第三军医大学学报，2003，25（1）：77—78.

[7] 陈世梁，卢志承，董玉英.介绍一种改良脱钙液在骨组织制片中的应用[J].临床与实验病理学杂志，2009，25（5）：557—558.

[8] 连丽琴，夏凌志，钟惠霞.三种脱钙液对骨组织脱钙后切片染色效果分析[J].武警医学，2008，19（10）：937—938.

免疫组化染色范文第3篇

【关键词】细胞学；薄层液基涂片；染色；方法

【Abstract】objective:tostudythin-layerliquid-basedcytologysmeartechniqueanditsapplicationinImmunohistochemistry.Method:theuseofcomparativesignificanceoftwogroupsofcases.Therewere74casesofadenocarcinomainpleuralfluid-basedsmear.40casesofsmallcell,resolvingphlegmandsmear.Secondgenerationusingimmunohistochemicaltwo-stepdye.Results:adenocarcinomainpleuraleffusionandascitesinathinlayerofliquidbasedsmearsadenocarcinomacellsonCEAantibody-negative,Mesothelialcellstomesothelin(mesothelin)antibody-positivesmallsmallcellundifferentiatedcarcinomacellandresolvingphlegmsmearonCHAantibody-positive.OnLCAantibody-positivelymphocytes.Conclusion:ImmunohistochemicalAntigen-antibodyreactionisahighdegreeofspecificityandsensitivityofbiochemicalreactions,toaspecificantigenrecognitionandstrong.Incells,subcellularleveldetectionAntigenmoleculeisdifficultforotherbiotechnologyandalternative.Onthecytologyhasbroadapplicationprospects.

【Keywords】Cytology;thinlayerliquidbasedsmears;dyeing;method.

【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0308-02

免疫组化是用特异性抗体对细胞或组织内的抗原进行定性、定位或定量检测。凡能作为抗原半抗原的物质，都可用免疫组化方法检测，近年免疫组化技术在病理组织学上广泛应用，但少见于细胞学薄层液基涂片的报道。本文总结细胞学薄层液基涂片的免疫组化染色实验，探讨免疫组化技术在细胞学上的应用。

1材料与方法

1.1材料：选用有对比意义的细胞学检材，记有腺癌性胸腹水薄层液基涂片74例，小细胞未分化癌涂片40例，试剂选用迈新公司Elivsionplus免疫组化试剂盒。

1.2方法：免疫组化二代二步染色法：1）胸腹水、痰薄层液基涂片、固定、潮干、PBS液洗涤。2）胰酶消化修复抗原，胶酶浓缩剂与稀释液按1:3滴加，37℃孵育15分钟，PBS液洗涤。3）阻断：滴加3%过氧化氢液，37℃孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS液洗涤。4）免疫反应，抗体依需要自选，滴加后37℃孵育1小时，PBS液洗涤。5增强反应，滴加增强剂，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤.6）标记：滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤。7）显色，滴加新制DAB液，镜下观察，显色适当后放入蒸馏水中终止反应。8）苏木素复染，中性树胶封固。

2结果

经反复实验总结出以上染色方法，可使阳性细胞液基涂片中的阳性细胞呈黄棕色或棕褐色。74例腺癌性胸腹水离心涂片中，变形未圆形、卵圆形，聚集成团的深染的腺癌细胞，与增生间皮细胞在镜下难以区别；通过免疫组化染色，腺癌细胞对CEA抗体显阳性，间皮细胞对mesothelin（间皮素）抗体显阴性。40例小细胞未分化癌痰涂片中，小细胞未分化癌细胞略大于淋巴细胞，圆形、卵形、短小梭形，核深染，与大淋巴细胞难以鉴别。通过免疫组化染色，小细胞未分化癌细胞对CHA抗体显阳性，淋巴细胞对LCA抗体显阴性，这样可以鉴别开来。

3讨论

免疫组化染色范文第4篇

【摘要】脑组织石蜡切片的染色结果，易出现切片染色不清楚，脱片、假阳性，假阴性出现。免疫组化这些结果的出现，与组织固定，抗原修复，内源性过氧化物酶活性的灭活，抗体质量，显色试剂质量，苏木素质量，时间上的把握及技术人员熟练程度有关，得出了免疫组化的过程的很多细节及各个步骤的主要的注意事项，提高脑组织切片的免疫组化染色操作技术。

【关键词】脑组织；石蜡切片；免疫组化；染色

随着免疫组化技术广泛应用于科学和医学各个领域的研究和诊断中，免疫组化的技术已经成为一种基本的检测技术，如何提高免疫组化的技术，特别是脑组织切片在免疫组化中的检测，是每一个科研人员在检测中最关心的问题，现将近几个月大鼠脑组织切片的免疫组化技术的一些体会和细节概况如下：

1 脑组织固定体会

用4%的多聚甲醛固定，固定之前要保持脑组织的平整和完整，不能被挤压，以免影响细胞的形态，影响电镜下观察。

2 脑组织防脱片的处理 

（1）传统的防脱片的处理方法有延长烤片的时间、提高烤片的温度和重新脱水［2］。免疫组化前，切片在58-60℃的恒温箱中烤2-24 h［1］，在脱蜡和脱水过程中，把切片稍晾干后再行下一步的免疫组化过程。但不能进行高温烤片，在干燥的条件下加热切片可以加速组织中抗原的氧化而破坏组织中的抗原［2］。

（2）玻片进行化学试剂处理玻片为充分洗净干燥的磨砂防脱载玻片。可以选用免疫组织化学染色中常用防脱片剂即多聚-L-赖氨酸(Poly-LLysine)对载玻片进行处理，处理后载玻片不易脱片。 

3 抗原修复

（1）少数抗体可以选择酶消化法.如原位末端标记法（TUNEL）试剂盒中以蛋白酶K为消化酶，在这过程中，注意蛋白酶K的浓度不能过高，过程中不能超过10 min，以免修复太过出现假阴性，且BPS洗涤要彻底。

（2）热修复注意事项。

高压加柠檬酸盐(pH6. 0)缓冲液修复，时间为5分钟，冷却后连续修复2次。水浴锅修复时水温为95℃，修复时间为15～60 min。须等缓冲液冷却至室温,才能把切片取出，取切片时防烫伤。

4内源性过氧化物酶活性的灭活

3%H2O2孵育时间一般8～10 min，时间过长易造成结果假阴性的出现。用BPS充分冲洗三次每次3 min，注意保证BPS的PH值在7.2～7.6。

5 滴加抗体和孵育时间

（1）试剂储存时间过长会影响抗体的有效价,所以试验前检查试剂是否在有效期内,并及时调整储存。一般抗体储存在-20℃的冰箱内，一抗是即配即用，根据说明书上一抗的浓度比例做预示实验，一般是1:50,1:100,1:150，1:200进行对比，然后按最佳效果的比例进行正式试验。

（2）滴加一抗二抗时,须用滤纸将切片周围和多余的BPS液体拭净,以防残留液体稀释工作液,出现不必要的假阴性。为了避免试验的误差，降低试剂的耗损，先离心积液再取用抗体，移液需精准。滴加抗体时须悬空滴加，不能触到脑组织，以免造成脑组织损伤。工作液须完全覆盖住脑组织，如若液体分布不均匀，可轻微晃动玻片或用移液枪头的外侧面但不接触脑组织撑开液面。

（3）不同的试剂的抗体孵育时间不同。在37℃恒温箱中孵育时，一抗的孵育的时间一般是2.5h，二抗为30min，二抗的时间随一抗的延长而延长。湿盒孵育可以在4℃冰箱过夜,孵育出的切片阳性率高。

6设置阳性对照片和阴性对照片

阴性对照和阳性对照需同时进行，但阴性对照组须与阳性对照组在操作上，所有步骤都应独立，独自漂洗，独自孵育，防止受抗体污染而出现阳性结果。

7显色试剂配制和时间

DAB显色剂应现用现配,注意颜色是否正常，新鲜配制的显色液为淡棕色，颜色过深，则不用。显色不宜超过10 min,一般是2-3min，否则易出现背景深染，或先在低倍镜下观察显色的程度，控制显色的程度，染色充分后立即终止。

8复染注意事项

（1）注意苏木素配置的时间，是长期还是短期的，观察其色泽，气味，注意苏木素配置的方法不同，其效用也不同，不全是存储越久，染色的质量越好。

（2）苏木素复染需2min,复染只需苏木素浅淡的染色,若过深的苏木素染色有可能覆盖已有的阳性染色。500ml苏木素染液染800-1000张玻片后需更新换液，保证染色质量［3］。每次染色之前应将染液通过滤纸过滤，保持染液干净，防苏木素中的过氧化物沉淀在玻片上影响美观。

（3）封片时宜湿封，防切片细胞龟裂，收缩或黑色结晶样小点，滴树胶不能过稠或稀，稠了会使树胶外溢，易粘在切片上影响美观，稀了封片产生气泡，这些均不利于镜下观察。

免疫组化的过程，看上是一个简单的过程，在这个过程中，每一个过程都是都是很重要的步骤，一步不慎，皆会影响到实验的结果。因此需要操作者每一步都要做到细致规范，熟练免疫组化的每一个步骤，每一个过程中的不同的方法及效果，通过反复的比较对照掌握免疫组化的过程中的方法和时间的把握，且按上面步骤注意操作后，能做出背景清晰，不脱片，易于镜下观察的脑组织切片。

文献摘要

［1］张惠球,刘奕生.免疫组织化学染色质量的影响因素［J］中国误诊学杂志,2006,6(3),571-572.

［2］王小亚,杨清海. 免疫组织化学标准化(一) ［J］. 诊断病理学杂志, 2001 (1) : 801.

［3］杨元发,李秀英.病理技术工作的质量控制［J］实用医技杂志,2008.15(8),1053-1055.

免疫组化染色范文第5篇

[关键词] 细胞涂片；细胞块切片；胸腔积液；免疫组化染色；诊断

[中图分类号] R730.48 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）01（a）-0179-02

胸腔积液的来源主要于非小细胞肺癌、肺腺癌和恶性彩胸膜间皮瘤等，长期以来，胸腔腔积液的诊断主要采用细胞涂片检查，其诊断的敏感度可达78%[1]。但单纯应用细胞涂片进行检查，无法对转移性癌和浆膜腔原发性间皮性肿瘤进行区别，这给临床治疗带来了较大的困难，目前临床研究发现，常规细胞块切片结合免疫组化染色的检测方法效果较好[2]。为探讨细胞块切片免疫组化染色在胸腔积液病理诊断中的应用价值，该研究采用常规细胞块切片结合免疫组化染色的检测方法对2010年6月―2012年7月收集82例胸腔积液患者进行诊断，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院呼吸内科收治的82例胸腔积液患者为研究对象，其中男52例，女30例，年龄16～77岁，平均年龄为（46.83±3.09）岁；纳入标准：送检标本均为胸腔积液；每1例患者均给予常规细胞涂片和细胞块切片及免疫组化染色检测。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 患者入院第2天清晨由护理人员收集患者新鲜的胸腔积液100 mL，分为4个试管进行离心，转速：2 500 r/min，离心时间：10～15 min；离心后采用移液枪吸出上清液；取部分沉渣进行常规细胞涂片学检查，合并余下的沉渣，加入戊二醛 2.5 mL 进行固定，离心，转速：2 500 r/min，离心时间：5 min；离心后采用移液枪吸出上清液，取出沉渣，滤纸包好后，常规脱水，用石蜡包埋切片，应用HE染色。

1.2.2 免疫组化 采用 Maxvision 快捷免疫组织化学 S-P法染色，Maxvision 试剂盒及二氨基联苯胺（ DAB） 显色试剂均购于福建迈新有限公司。CEA、CK7、WT-1、CR抗体均购于自基因公司，染色过程严格按照试剂盒说明书进行。

结果判断[3]：CEA 及 CK7 在胞浆或胞浆胞膜同时出现棕黄色为阳性，Calretinin在细胞浆、细胞核和细胞膜或细胞浆膜出现棕黄色为阳性，WT-1 的细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。间皮细胞或腺癌细胞达 10% 以上细胞阳性诊断为阳性。

1.3 统计方法

采用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 各组阳性率比较分析

细胞块切片结合免疫组化阳性82例，阳性率为100%，常规细胞学涂片的阳性46例，阳性率56.10%，细胞块切片结合免疫组化阳性率明显高于常规细胞学涂片，差异有统计学意义（P

2.2 腺癌与间皮性肿瘤细胞不同抗体表达分析

结果显示，CEA、CK7 是腺癌较为特异性的抗体，而CR 是间皮性肿瘤细胞较为特异性的抗体，各抗体在腺癌细胞和间皮性肿瘤细胞均有交叉表达，见表 2。

3 讨论

胸腔积液是胸部肿瘤的常见并发症[4]，肿瘤患者并发胸腔积液后，使间皮细胞、肿瘤细胞均浸泡于胸腔积液中，长期受胸腔积液的刺激，致使间皮细胞和肿瘤细胞均发生形态学改变，而使两种细胞应用常规方法很难鉴别是出来[5]。传统的检测方法是细胞学涂片，常规细胞学涂片操作易于掌握，且可有效保持细胞的形态特点，但其准确性及敏感性不高，尤其是对恶性胸腔积液患者的诊断准确性较低，约为60%[6]。

免疫组化染色法是利用已标记的特异性抗体来检测细胞内未知抗原，并通过酶所产生的着色反应来显示细胞的活性、定位及其分布。此方法操作易于掌握，阳性物质定位准确、特异性强。同时，细胞块的应用弥补了传统细胞涂片方法单一的缺点，使细胞标本得以保存，具有了连续切片的性质，更利于进行多项检查。

该组研究结果显示，常规细胞学涂片的诊断阳性率为56.10%，这与以往报道相似。采用CEA、CK7、WT-1、CR抗体进行免疫组化检验，结果显示，82例患者均得到了明显的诊断，其诊断阳性率为100.00%；说明细胞块切片联合免疫组化染色可显著提高胸腔积液诊断的阳性率，为临床的治疗提供了理论参考，值得临床广泛推广和应用。

[参考文献]

[1] 斯向东，李庆.细胞块切片及免疫组化在恶性浆膜腔积液诊断中的应用体会[J].中国现代医生，2011，49（28）：114-115.

[2] 张志刚，梁希军，崔东辉，等.间皮细胞、癌胚抗原、角蛋白、波型蛋白在胸腔积液临床诊断中的作用[J].中国全科医学，2007，10（24）：2080-2081.

[3] 侯刚，尹燕，韩丹，等.胸腔积液脱落细胞免疫组化染色对肿瘤来源鉴别诊断价值的探讨[J]. 中华肿瘤防治杂志，2012，19（21）：1647-1648.

[4] 唐应成，梁利斌，杨瑞仙，等.胸腔积液细胞块免疫组化染色的病理诊断价值[J]. 第三军医大学学报，2012，34（15）：1568-1569.

[5] 谢深科，舒千玉，姚军.细胞块免疫标记在胸腹水细胞病理诊断与鉴别诊断中的价值[J].中国医疗前沿，2011，6（4）：73-74.

[6] Swiderek J，Morcos S，Donthireddy V，et al. Prospective study to determine the volume of pleural fluid required to diagnose malignancy[J].Chest，2010，137（1）：68-73.

免疫组化染色范文第6篇

[关键词]微波；超声；牙齿；脱钙方法；免疫组化

[中图分类号]R783.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）06-0955-03

牙体组织结构较为特殊，其硬组织中含有大量钙盐（洛氏硬度值达340）[1]，是全身最坚硬的组织，不易切片极易脱片，因此在病理制片过程中首先要脱去其中的钙盐再进行制片，而位于牙体硬组织中心的牙髓为柔软的结缔组织，在制片过程中易受挤压、牵拉而至变形、分离甚至脱落流失，脱钙不佳也会影响组织细胞染色效果或使组织抗原丢失[2]，从而影响对病变组织的病理诊断或科学研究工作。因此合适的脱钙方法成为牙体组织制片，进行免疫组化染色实验首先要解决的难题。本实验中对微波、超声、微波-超声联合脱钙法的脱钙效果，及不同脱钙方法对牙体组织免疫组化染色抗原的影响程度进行了初步检测，旨在寻找出更适合牙体组织免疫组化染色实验的脱钙方法。

1 材料和方法

1.1 材料：收集因正畸拔除的健康人前磨牙40颗,患者年龄17～25岁,牙齿完好。经生理盐水冲洗后,入4%多聚甲醛溶液固定24h。

1.2 仪器试剂：微光波炉（WG700TL20Ⅱ-k6,广东格兰仕集团有限公司）；KQ118型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ⅰ型胶原蛋白抗体(武汉博士德公司)；纤维粘连蛋白抗体(武汉博士德公司)；SABC试剂盒(武汉博士德公司)。

1.3 脱钙液配制：10% EDTA脱钙液：EDTA-2Na 100g，NaOH 10g，加双蒸水1000ml于容量瓶中,微加温溶解，调pH值至7.2～7.4[3]。

1.4 方法：40颗牙随机分成四组：微波组（Ⅰ），超声组（Ⅱ），微波-超声联合组（Ⅲ），常温对照组（Ⅳ）。将四组牙分别放入四只250 ml小烧杯内，各加入脱钙液150～200ml。按下列四种方法脱钙：Ⅰ组：将小烧杯放入加有冷水的500ml大烧杯内；置于微波炉中（低档，输出功率150W），脱钙10min后，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅱ组：将小烧杯放入超声波清洗器中（35℃，150W），脱钙10min，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅲ组：将小烧杯放入超声清洗器中脱钙10min（条件同Ⅱ组），再放入微波炉中脱钙（条件同Ⅰ组）进行第二次脱钙，如此反复进行，每日脱钙24次。Ⅳ组：将小烧杯放于室温下静置脱钙。注意各组脱钙过程中脱钙液温度以不超过50℃为宜，各组每日更换新脱钙液一次，直至脱钙完成（以大头针无阻力可刺入组织为脱钙完成的标志）。牙齿脱钙完成后,常规石蜡包埋，唇舌向切片数张。进行免疫组织化学染色。

1.5 免疫组化染色：石蜡切片经常规脱蜡至水,蒸馏水洗5min×3次；3% H2O2室温孵育10min,蒸馏水洗5 min×3次；室温下复合消化酶消化10 min,PBS洗2 min×3次；滴加BAS封闭液,室温20 min,甩去多余液体；分别滴加一抗（兔抗人Ⅰ型胶原抗体，抗体滴度1∶50；兔抗人纤维粘连蛋白抗体，抗体滴度1∶150），4℃过夜；PBS洗2 min×3次；生物素化二抗室温孵育20 min,PBS洗2 min×3次；SABC液室温作用20 min,PBS洗5min×4次；显微镜监控下DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、树胶封片,显微镜下观察。阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤同上。

1.6 图像分析及统计学处理：应用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统，运用Image-Pro-Plus图像分析软件进行平均光密度值（integral optical density，IOD）测定，取其平均值。图像分析结果以均数±标准差 (x±s)形式表示。运用SPSS13.0统计软件对所测得的数据进行方差分析。各实验组与对照组OD值之间进行Dunnett-t检验。各实验组OD值之间进行SNK-q检验。

2 结果

2.1 四种脱钙方法完成脱钙所需时间的比较 (见表1) 。

2.2 免疫组化染色结果：四种不同脱钙方法免疫组化染色效果存在差异，两种不同抗体染色结果均表明：微波-超声联合组免疫组化染色效果佳，好于其它各组(P

3 讨论

免疫组织化学染色技术是用已知的标记的特异性抗体或抗原对组织内相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，从而了解抗原或抗体结合部位和含量的一门新兴检测技术[4]。在探讨疾病的病因学、发病机制及科研工作中起到了不可估量的作用。免疫组化染色过程环节较多，而组织的脱钙方法是牙体组织免疫组化染色的最关键的步骤之一。如果脱钙不彻底可导致切片破碎甚至无法制片，脱钙方法不佳导致组织抗原丢失影响实验结果。因此，如何快速有效脱钙至关重要。

目前，有研究表明，与其他强酸(如硝酸、盐酸、甲酸等)相比EDTA-2Na是科研中较理想的脱钙剂，尤其是免疫组织化学实验，而微波-EDTA联合脱钙时，则可以明显提高脱钙速度[2,4,10]。也有学者研究发现，超声振动可加增加相互碰撞机会，提高分子平均能量，加剧分子运动降低反应活化能，从而提高化学反应速度，甚至改变化学反应机理，启动新的反应渠道[5-6]。使用超声波对骨组织进行脱钙，也可取得较好的脱钙效果[7-8]。但超声用于免疫组化实验中牙齿脱钙的相关报道较少。

本研究中，用EDTA脱钙液，采用微波、超声、微波-超声联合及常温下对牙体组织的脱钙情况以及不同脱钙方法对免疫组化染色的影响程度进行了比较。对两种抗体的检测结果均表明：在四种脱钙方法中微波-超声联合组脱钙效果最好，免疫组化染色效果最佳。其原因可能是因为在微波电磁场作用下，使脱钙组织中排列混乱的极性分子快速转向，并定向排列，在运动、摩擦、碰撞过程中产热使脱钙速度加快；超声辐射所产生的能量可以使反应体系破碎、分散、雾化混合,增加反应界面，打开化学键，反应的进行同时也可引起加热效应等来促进化学反应的进行。另外超声波的作用使络合产物和中间体及时离开反应界面，类似高效的机械搅拌[9]。因此可能是当微波-超声联合应用时，通过超声将牙体表面磷酸钙晶体溶解，形成EDTA-2Na和钙的螯合物，超声振动，将牙体表面钙团洗脱，打开更多通道与脱钙液接触，进而更加利于微波脱钙，从而使脱钙时间缩短。另外分析可能是因为EDTA-2Na有萃取某些基质蛋白的作用[11],常温组脱钙时间过长降低了抗原的免疫反应性。而微波组和超声组可能是由于在脱钙时间上没有明显的差别，因此其免疫组化染色强度无显著差异（P＞0.05）。微波-超声联合组由于脱钙时间的缩短，减轻了脱钙液对脱钙组织的破坏，使组织中的抗原以及细胞形态和组织结构得到了较好的保护，因此免疫组化染色更强。并且，可能是因为该法脱钙更为均匀彻底[3]，更进一步提高了制片的质量。

总之，在实验中发现，采用微波-超声联合脱钙，且注意实验中各环节标准化操作，可缩短脱钙时间，获得较满意的染色效果，提高制片质量。但本实验中仅对Ⅰ型胶原蛋白、FN两种抗体的某一选定浓度进行了检测，尚未对其它浓度及更多抗原进行测定，仍存在不足之处，对微波-超声联合法脱钙的化学反应机理还需进一步研究。

[参考文献]

[1]于世凤.口腔组织病理学[M],5版.北京:人民卫生出版社,2003:42．

[2]熊正文,黄勇,胡海霞,等.微波-EDTA快速脱钙技术及其在免疫组化染色中的应用[J].解剖学杂志,2003,26(5):506-508．

[3]刘英群,祝莹颖,王桐.微波和超声对人牙脱钙效果的比较研究[J].中国地方病学杂志,2006,25(6)：707-709.

[4]熊正文.免疫组织化学中抗原修复的研究进展[J].中华病理学杂志,1997,26:124.

[5]Said K,Moussaoui Y,Kammoun M,et al.Ultrasonic activation of Heck type reactions in the presence of Aliquat-336[J]．Ultrason Sonochem,2011,18(1):23-27．

[6]Kumar D,Kumar G,Poonam,et al．Ultrasonic assisted transesterification of Jatropha curcus oil using solid catalyst，Na/SiO［J］．Ultrason Sonochem,2010,17(5):839-844．

[7]法京,沈强,俞彰,等.超声波骨组织电镜样品脱钙处理的实验研究，复旦学报(医学版),2003，30 (2):117-119.

[8]任智超,王欣,刘宝林.超声波辅助脱钙技术用于猪脱钙骨基质制备的效果评价[J]第三军医大学学报,2011,33(11):1165-1169.

[9]Zabaneh M,Bar R.Ultrasound-enhanced bioprocess.Ⅱ:dehydrogenation of hydrocortisone by arthrobacter simplex[J].Biotechnol Bioeng ,1991,37:998.

[10]任智超,王欣,刘宝林.微波辅助脱钙技术在猪脱钙骨基质制备中的应用研究[J].中国生物医学工程学报,2011,39(5):762-767.

[11]Holly C,Peter D.Form and function：the laminin family of heteotrimers[J].Dev Dyn,2000，218(2):213-234.

免疫组化染色范文第7篇

[关键词] 免疫组化; 质控; 病理; 医技人员; 沟通交流

[中图分类号] R446.8 [文献标识码] C [文章编号] 1673-9701(2009)23-121-02

免疫组化是目前病理诊断方面广泛应用的新技术,在病理诊断鉴别肿瘤中起重要作用,也是指导临床肿瘤治疗和判断肿瘤预后的重要依据[1]。免疫组化发展较快,染色结果受多种复杂因素影响以及病理诊断和病理技术二者均充满个性化,颇具经验型,难以标准化,造成目前免疫组化质量难以令人满意[2],免疫组化结果的可靠性,准确性引起了业内极大的关注。因此,强化病理实验室免疫组化质控成为当前病理学科发展的迫切要求[3] 。

1 质控中医技人员沟通交流的重要性

1.1 对免疫组化质控的正确理解是基础

免疫组化染色结果受制片因素、染色方法、染色流程、试剂质量、实验室条件等综合因素影响。同一种抗原可以在多种肿瘤或组织中表达,没有一种完全针对某一肿瘤或组织的特异性抗体,也给免疫组化染色结果的正确判断带来困难和一定局限性。免疫组化结果判断的正确性和可靠性体现病理医技人员综合水平[4]。免疫组化具有非常强的技术性和实验性特性决定了要做好免疫组化确实不易。强化免疫组化质控,使免疫组化操作逐步规范化、标准化、正规化,对切实提高免疫组化染色质量,同时促进和提高病理实验室质量管理水平具有很重要的现实意义。

1.2 沟通交流是做好免疫组化质控的现实需要

目前,欧美发达国家免疫组化质控有一套比较先进的方法和程序,国内免疫组化质控方法正处于摸索之中,免疫组化质量尚未形成一个权威性标准。在免疫组化标准化欠缺足够重视、免疫组化质量参差不齐的状况下,面对多种复杂因素影响的免疫组化染色结果,要做好免疫组化质控工作必须依靠病理医技人员通力合作。病理医生和技术人员历来关系微妙,如果都站在各自立场上,很难客观正确解读清楚免疫组化染色结果现象如染色结果表达与不表达,该不该表达的真正意义和原因,免疫组化染色结果可靠性将会受到影响。因此,在免疫组化室内质控和室间质控中非常需要加强彼此之间沟通交流,发挥诊断医生主导作用,改变诊断医生只关心染色结果、技术人员只管技术操作的现状[5],实事求是综合分析判断整个免疫组化制片过程、染色过程、正确评估染色结果,从而促进免疫组化规范化和标准化,提高免疫组化病理诊断的质量和水平,和谐病理医技人员关系。

2 做好医技人员沟通交流的关键

2.1 相互理解和尊重

一般情况下,病理医生关注的只是免疫组化染色结果,对染色结果判断体现医生业务水平。技术人员是免疫组化实际操作者,理论水平不足,操作受各种技术条件因素影响较大。医技人员相互之间应该尊重,不要各自从专业技术解读染色结果,应该站在对方角度理解各自专业的能力和局限。大家要充分认识到:做好免疫组化质控,提高免疫组化质量对病理医技人员都必须有一个认识过程和经验积累过程,正确解读免疫组化染色结果也需要有一个不断认识过程,并且这是一个相互促进的过程。一些单位开展免疫组化质控但效果不明显,很大程度上是医技人员之间的理解和尊重问题以及出现问题后双方之间缺乏有效的沟通交流。医技人员之间相互理解和尊重应该是做好免疫组化质控的最关键因素,相互之间有效沟通交流是做好免疫组化的现实基础。

2.2 提高专业水平

专业水平不高,难以沟通。免疫组化发展较快,试剂种类增多、染色方法改进、操作流程更新,理论观念变化都需要病理医技人员加强学习。专业素质提高了,对染色结果原因有了客观理解和正确评估,更有利于病理医技人员做好免疫组化质控,提高免疫组化质量,认识免疫组化机制,有效发挥免疫组化在病理诊断和指导临床肿瘤治疗中的积极作用,共同推动免疫组化的不断进步和发展。

3 医技人员有效沟通交流的方法和技巧

3.1 建立免疫组化工作单加强室内质控

免疫组化工作要标准化,需要有严格的质量控制。病理医技人员要根据自己实验室具体情况共同讨论制定免疫组化工作单内容,将制片程序[6]、试剂类型、染色方法、操作程序、适合的质控对照和实验条件细化列入室内质控免疫组化工作单,每次操作中都认真实时记录,客观反映免疫组化染色全过程,给医技人员正确判断染色结果,分析结果原因和总结经验提供客观依据和方向,为尽快找到一种较好的、标准化的免疫组化染色方法,摸索出一种适合本实验室免疫组化质量控制的方法[7]打开思路。避免医技人员之间对染色结果缺乏依据猜测引发误解,营造科室宽松的学术氛围和正常和谐的专业技术反馈机制。在做好免疫组化室内质控中,摸索最佳抗体和染色流程、最佳实验室条件以及结果正确分析和问题原因查找更需要医技双方坦诚交换意见和建议。

3.2 参加全国免疫组化质控网活动搞好室间质控[8]

全国免疫组化质控网通过病理专家和试剂公司技术专家对统一分发切片的染色效果按照免疫组化质控标准测评,找出普遍存在问题,提出改进意见,推荐最佳抗体和染色流程,为免疫组化染色规范化起到了很好的促进作用,参加的单位都得到较大提高。争取参与其中室间质控活动,了解专家对本单位免疫组化染色结果的评估,分析本单位与优秀实验室的质量差异,病理医技人员可以明确知道本单位免疫组化染色结果真实情况,找到准确解读染色结果的方法,在较高技术层次对比中找差距,分析原因,学习和借鉴国内外好方法好经验,不断改进操作提高免疫组化质量。这些无论对诊断医生还是技术人员在免疫组化规范化学习方面都是最便捷、提高最快、效果最明显的好方法。

病理医技人员之间相互沟通交流是打开免疫组化质控的一扇窗户,效果取决于病理医技人员共同努力,效应体现在免疫组化质量上。

[参考文献]

[1] 陈磊. 分子肿瘤病理学的新进展[J]. 癌症杂志,2007,26(1):106- 112.

[2] 刘复生,刘骅,吕福东,等. 免疫组织化学技术在肿瘤病理诊断中的应用及其存在的问题[J]. 癌症进展杂志,2007,5(4):355-361.

[3] 陈杰,郑杰,霍临明. 重视免疫组织化学的质量控制和标准化[J]. 中华病理学杂志,2005,34(2):65-66.

[4] 马大烈,白辰光. 免疫组织化学阳性标记结果的观察和判断[J]. 临床与实验病理学杂志,2003,19(5):557-559.

[5] 周小鸽. 重视病理医生在免疫组织化学应用中的主导作用[J]. 中华病理学杂志,2004,33(6):77-79.

[6] 梁英杰. 免疫组织化学技术制片的规范和质量控制[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2004,13(2):262-264.

[7] 王小亚,杨清海,黄奇平. 免疫组织化学标准化(一)[J]. 诊断病理学杂志, 2008,15(1):80-81.

[8] 周小鸽. 全国性免疫组织化学质量控制活动介绍及总结[J]. 临床与实验病理学杂志,2007,23(4):510-511.

免疫组化染色范文第8篇

【关键词】 脱钙条件；骨组织；免疫组织化学染色；抗原性

【Abstract】 Objective To analyze influence by different decalcification conditions on bone tissue antigenicity in immunohistochemical staining. Methods Decalcification was made through 8% nitric acid under microwave， light wave， light wave + microwave Ⅰ and light wave + microwave Ⅱ in bone tissue. Decalcification under room temperature （20℃） was taken as control group. Labelled streptavidin biotin method （LSAB） immunohistochemical staining was applied to analyze and compare stain effects. Results Decalcification time under microwave， light wave， light wave + microwave Ⅰ and light wave + microwave Ⅱ were all shorter than control group， and their immunohistochemical staining effects were all better than control group （P

【Key words】 Decalcification condition； Bone tissue； Immunohistochemical staining； Antigenicity

目前， 免疫组化染色技术是临床病理鉴别及诊断的重要手段， 骨组织由于含有丰富的钙盐， 因此其免疫组织化学染色自然与常规石蜡切片有所区别， 通常需要先去除钙盐后才可制成比较薄的切片， 然后再进行常规脱水、透明处理等操作[1]。本研究旨在分析探讨不同脱钙条件对骨组织免疫组化染色抗原性的影响， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 选取2012年4月～2015年8月骨外科送检的人骨组织， 脱钙液为硝酸10 ml+蒸馏水190 ml制成的硝酸液。Panasonic NN-DF382M光波/微波炉1台， 微波额定输入功率为1400 W， 光波额定输入功率为1050 W， 微波额定输出功率为900 W， 额定输出频率为2450 MHz， 输出功能共分为微波、光波及光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ。微波输出功率为5个调节档， 光波输出功率为单一光波管发光， 光波+微波组合Ⅰ为微波输出时间的30%+光波输出时间的70%， 光波+微波组合Ⅱ为微波输出时间的55%+光波输出时间的45%。

1. 2 方法 将1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm的骨组织分别用8%硝酸分别于微波、光波及光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ的条件下进行脱钙。将脱钙后的骨组织常规制成切片， 经复合酶消化石蜡切片后， 运用LSAB免疫组化进行免疫酶细胞化学染色。

1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P

2 结果

微波、光波、光波+微波组合Ⅰ及光波+微波组合Ⅱ的脱钙时间显著低于对照组， 且免疫组化染色效果显著优于对照组（P

3 讨论

骨组织含有大量的钙， 质地坚硬， 一般不可直接进行制片染色， 需要经过脱钙处理的特殊工序。对病理活检苏木精-伊红染色（HE染色）的效果不会构成比较大的影响， 但是在很大程度上会影响到免疫组化染色抗原性[2]。近些年， 微波辐射技术逐步深入应用到骨组织脱钙、免疫组化染色、抗原修复等， 且效果突出， 特别是EDTA快速脱钙、微波-低温硝酸等技术对最大化地保留脱钙组织的抗原性做出了重要的贡献[3， 4]， 而光波+微波脱钙到底对免疫组化染色抗原性的实际影响在文献报道中鲜见。

本组研究中光波-微波组合Ⅱ脱钙时间在集中脱钙方法中是最短的， 而室温下的骨组织与切片呈现出淡黄色， 脱钙时间最长。就免疫组化染色效果来说， 室温条件下的脱钙组织最差， 微波、光波条件下的脱钙组织相对较好， 光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ条件下的脱钙组织最好， 主要是因为微波与光波的双重作用促使了骨组织的钙盐的反应速度进一步加快， 使得过去的常规脱钙方法少至数小时多则几天的反应时间大大缩短以致在短时间内便可完成， 因而最大化地保留了抗原性， 提高了免疫组化染色的效果。

在光波+微波-硝酸脱钙的应用过程中应注意如下几方面：①微波与光波的双重作用会使得脱钙液温度在短时间内迅速升高， 因此结合预冷降温措施可很好地减轻温度对抗原性的影响[5]。②不宜使用金属容器盛装脱钙液， 且要保证充足的脱钙液量， 通常情况上要达到标本的20～30倍左右， 并要更换1～2次新液。③骨组织厚薄适宜， 5 mm左右为最宜， 以防脱钙时间过长而损及组织形态结构、影响染色效果。

综上所述， 8%硝酸光波+微波组合脱钙时间要明显短于微波、光波及室温脱钙， 且具有良好的免疫组化染色效果。

参考文献

[1]杨传红， 赖晃文， 唐云， 等.微波快速脱钙及其脱钙液的选择. 临床与实验病理学杂志， 2010， 12（4）：357-358.

[2]刘海芳. HE染色切片褪色后免疫组化染色方法研究.中国现代医生， 2011， 49（17）：81-82.

[3]熊正文， 李宏伟， 黄勇， 等.骨组织脱钙技术及在免疫组化染色中的应用研究.中国比较医学杂志， 2011， 14（3）：175-178.

[4]熊正文， 朱光君， 黄勇， 等.骨组织的脱钙及其免疫组织化学染色技术探讨.中国组织化学与细胞化学杂志， 2010， 11（3）： 347-349.

[5]张绪斌， 熊正文， 张华东.骨组织脱钙技术及其应用.医学理论与实践， 2011， 24（11）：1264-1267.

免疫组化染色范文第9篇

概述：当前，经过权威资料认证的免疫组化实验方法，已经对免疫组化的最基本问题做出了解答，并可以作为免疫组化技术中一种相对的标准。本文对免疫组化的操作步骤作出了一些具体的描述，提出了一些注意事项，并且对当前、今后的免疫组化自动化和标准化作出了评价和展望。

免疫组织化学在病理诊断中的作用已得到广泛的认同，具有特异性高、敏感性高、程序相对一致等特点，并已成为病理诊断中不可或缺的重要辅助技术。尽管免疫组化的理论比较简单，但方法与步骤却比较繁琐，在实际应用中还存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断。要想达到可靠的实验结果，最重要的是将免疫组化技术的全部程序形成一种概念上的标准化。本文就免疫组化技术的标准化进行一些浅显地探讨。

1 标本的固定

为了使细胞和组织保持原有的形态结构，防止组织自溶和抗原性丢失，固定是关键。标本离体后要求在15分钟内用10%中性缓冲甲醛固定，在常温下时间为8-24小时，避免过度固定，固定时间过长，切片中容易产生甲醛色素颗粒，会影响结果观察以及抗原的破坏。固定组织的固定液为标本体积的5-10倍，脱钙液对抗原也有较强的破坏，所以浓度和脱钙时间不易太长。

2 防脱片的制备

目前通用的是Sigma多聚左旋赖氨酸（Poly-L-ly-sine）或硅化片，具有很理想的防脱片效果。

3 包埋与切片

用过高温度的石蜡包埋组织会破坏抗原，对于固定不太好的组织影响更大，包埋用的石蜡应选用低熔点的石蜡，切片的厚度在3-4微米，以利于观察，太厚的切片会影响染色结果和诊断。

4 烤片

切片在50-60℃的恒温箱里烤片2小时，至少1小时才不至于脱片，烤片时间过短易脱片，时间过长或温度过高会破坏抗原。

5 脱蜡

免疫组化的脱蜡应与常规HE脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，脱蜡不彻底会影响组化染色结果，切片脱蜡后进入梯度乙醇脱水至水化。

6 抗原修复

6.1 抗原修复是组化的关键技术

免疫组化染色中最关键的步骤可以说是抗原修复了，组化染色结果的表达与抗原修复直接相关。因组织被甲醛固定后蛋白质发生交联，抗原决定簇封闭，只有恢复抗原的免疫原性才能完成免疫化学反应。抗原修复方法有多种，主要是酶消化法与加热修复两种方法，现在由于加热抗原修复方法的广泛应用，酶消化法在免疫组化中的应用已很少。免疫组化的加热抗原修复方法包含微波法、水煮法、高压法，现在比较公认的修复效果是高压法大于水煮法，水煮法大于微波法。

6.2 抗原修复液的选择

抗原修复液有多种，有柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）、EDTA（PH8.0）、Tris（PH7-8）等，目前柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）可作为首选的常规使用的抗原修复液，它适合于大多数种类抗体，染色背景清晰。一般抗原难以表达的可以选择EDTA和Tris缓冲液，这两种修复液对一部分抗原修复效果较强，但染色背景较深。

6.3 抗原修复实例

在全国，有多家实验室对ER、PR进行了反复实验，得出的结论是强力推荐使用高压抗原修复方法。

我们单位在最近的免疫组化测评赛中，对参赛的5个待测抗原进行抗原修复，取得了比较满意的结果。根据我们得出的经验，检测CD10、CD30这两项抗原，我们推荐使用高温水煮修复，修复液为tris-EDTA(PH9.0)，检测ER、PR、CK这三项抗原，推荐使用压力锅，修复液为柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），各单位可根据实验室的具体条件和经验选用微波、水煮、高压修复以及抗原修复液。

6.4 高压抗原修复方法

组织切片经二甲苯脱蜡至水，浸泡于蒸馏水中待用，取一定量抗原修复液于压力锅中，修复液必须浸没整张切片，加热沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，放入已沸腾的修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气（整个时间约需4-5分钟），开始计时1-2分钟后，压力锅离开热源，室温冷却15分钟，取下气阀，打开锅盖，切片冷却至室温后，蒸馏水洗，PBS洗2min×3次。

7 生物素封闭

一般进行抗原修复处理的切片都需要进行内源性生物素封闭处理；

7.1 3%H2O2浸泡切片10min

在免疫组化染色中如果采用过氧化物酶检测系统，必须进行封闭处理，这样可以消除组织中的红细胞、粒细胞对染色结果的干扰。虽然3%的H2O2对抗原有轻微的损害，但封闭效果非常显著。

7.2 血清封闭

一般在加载一抗之前使用封闭血清（室温15-20分钟），可以减少非特异性显色。血清的种属一般与二抗的种属相同，一抗中若含正常血清则可以免去此步骤。

实验中通常用的冲洗缓冲液为PBS和TBS，加入Tween20可以加强冲洗效果，在组化染色中严格的冲洗可防止背景着色。

8 一抗孵育

加载一抗50-100ul，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时，如4℃过夜后需在37℃复温45分钟，PBS洗3次各2分钟。

9． 加一滴（50ul-100ul）检测试剂（二抗），室温或37℃放置30分钟， PBS洗三次，每次2分钟。

10. DAB显色5-10分钟

11. 苏木素复染、脱水、透明、封片。

衬染的步骤十分简单，但衬染的好坏对染色质量的影响很大，不易太深或太浅。首选的是Harris苏木素衬染，它在水中洗涤后可以呈鲜亮的兰色，与DAB染色对照效果很好，使用简单方便。

对于即用型抗体，厂商已进行多种实验条件的检测，可以直接使用，而浓缩性抗体，可按照供应厂商提供的稀释度进行预实验，一般在厂家提供的滴度前后各加一个滴度做预实验，抗体的最佳稀释度为在无背景染色的情况下获得最强阳性信号。

通用的检测系统是生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法，有SP、LSAB、ABC等方法，都是目前实验室广泛采用的检测方法，其方法简便易行且试剂稳定。SP三步法和Envision二步法高效经济，为国内免疫组化首选的检测系统。

显色系统通常采用的是辣根过氧化物酶系统，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）酶底物，常规组化显色首选的是DAB，它定位清晰，易于保存。

在免疫组化的质量控制中，最重要的是设立阳性和阴性对照，每批实验中最好有一张阳性对照和阴性对照，这样才能确保实验的可靠性，虽然很多医院病理科的工作量很大，但是不要怕麻烦，可以每月进行一次室间质控，以保证免疫组化染色结果的可靠性和准确性。

自动染色仪，它是一种各种试剂高度通用的仪器，可使用大多数免疫组化染色的抗体、检测系统和其他试剂，是当今最流行的开放式的自动染色仪。它利用电脑控制代替技术人员手工操作，大大地减少了手工操作出现的误差。自动染色仪能精确泵出每次滴加试剂的量，以及将每一步的染色时间精确到秒，空气压缩泵能均匀地吹掉切片上多余的液体，这一切彻底避免了免疫组化染色过程中人工操作的误差，染色仪将所有的染色步骤存储在电脑里，这些优点保证了染色结果的一致性，不同单位的实验室选择相同的试剂及染色过程就可以达到相同的染色结果。

近年来，随着免疫组化标准化的逐步实行，免疫组化自动染色仪将逐步进入病理科，技术人员将从烦琐的人工操作中解脱出来，会极大提高免疫组化的工作效率，同时也将免疫组化标准化推上了一个新的台阶。

为了尽快实行免疫组化标准化，还需具备以下条件：① 有丰富经验的病理医生② 有丰富经验的技术人员 ③ 可靠的标准化操作方法④ 合格稳定的免疫组化试剂⑤ 科学地设立对照实验⑥ 阳性和阴性的正确判定⑦ 诊断中抗体的联合应用⑧ 自动化的免疫组化染色。

免疫组化染色范文第10篇

由于骨髓组织含有大量的钙盐而非常坚硬，不能直接进行石蜡制片，而经过脱钙处理后，才能进行切片、HE染色、特殊染色和免疫组化染色。脱钙过度或不当均可影响上述染色。因此，脱钙时间和脱钙液的选择十分重要。传统的方法用14%硝酸脱钙液脱钙常出现脱钙过度或不足，难以掌握，常造成组织切片不完整、组织结构破坏、细胞模糊不清，以致医生阅片时诊断困难甚至误疹。为此，近一年来，笔者用4%盐酸脱钙液，代替原有14%硝酸脱钙液，进行骨髓组织脱钙，取得到了比较好的效果，也避免了用塑料包埋切片后，不能进行免疫组化染色的不足。现将方法介绍如下。

1 材料和方法

1．1 材料 中山一院2007年全年骨髓活检标本480例。

1．2 方法 第1天：新鲜的骨髓标本立即置于10%甲醛液固定（过夜）。第2天：08：00上班，立即置于4%盐酸脱钙（3．5～4 h）：稍水洗。11：30置于70%乙醇30 min；12：00流水冲洗2．5 h，然后转入10%甲醛液补充固定。17：30分将骨髓标本与当天标本一起放入全封闭自动脱水机中脱水。第3天：石蜡包埋、切片、染色、出片交医生发报告。

2 结果

与以往用14％硝酸脱钙相比，骨髓切片完整，细胞形态保存良好，染色鲜艳，核质对比清晰，并且免疫组化染色得到的效果较好。见图1~4。将骨髓组织，在固定充分的情况下进行14％硝酸与4％盐酸脱钙的比较，见表1。

3 讨论

过去，骨髓组织制片多采用甲基丙烯酸乙基（HEMA）等特殊包埋剂包埋，不需经脱钙处理可进行切片HE染色，但操作类烦琐也不能作免疫组化染色，因此， 笔者这样脱钙处理进行石蜡切片的技术方法，以满足临床病理诊断免疫组化辅助的需要。常规骨组织脱钙主要采用14％硝酸脱钙，但硝酸对骨髓组织破坏极大，免疫组化染色效果不佳。

实践证明，过去用的14%硝酸对骨髓组织脱钙，具有作用快，脱钙能力强的特点，但由于硝酸是强酸，往往对骨髓组织脱时间不易控制（以大头针能刺入骨髓组织无阻力感为标准来衡量脱钙时间），常出现脱钙不足或脱钙过度等状况。脱钙时间过长，骨髓组织破坏，结构模糊不清或者无法制片；脱钙时间过短，脱钙不充分，骨髓组织较硬，以致无法制造出完整的切片。

医院早上送来的骨髓组织，往往是刚刚穿刺的新鲜标本，固定时间还不够。需要进上步固定过夜，这样做与当天穿刺当天取材制片的比较，切片完整，厚薄均匀，细胞结构保存良好，免疫组化、特染染色效果较好。相反，固定时间不够的骨髓组织，无论在切片、HE染色、特殊染色和免疫组化中，染色效果都不理想。以致病理医生难以作出诊断，拖延了病理报告发出的时间，甚至造成误诊。

由于骨髓组织富含钙盐、纤维支架少，组织具有硬、脆、疏松的特点，4%盐酸脱钙液酸度比硝酸脱钙液酸度比硝酸脱钙液浓度较低，因此采取延长脱钙时间的做法，使脱钙过程缓慢而较持久地进行（脱钙时间一定不能少于4 h，以大头针能穿过无阻力为准，骨髓组织脱钙才算完成）。流水冲洗一定要充分，如果冲洗时间不够，骨髓组织带有酸性，HE染色时胞核着色偏浅，核质对比不清晰，免疫组化假阳性率高。因此流水冲洗时间不能少于2．5 h。

盐酸会使组织膨胀，而酒精对组织具有收缩作用。因此，脱钙后将组织放入70％乙醇作用30 min，以减低盐酸对组织影响。经过一段时间的反复比较和实践，用4％盐酸脱钙的方法能使骨组织切片、HE染色、特殊染色和免疫组化染色达到较稳定的效果，达到优质骨髓切片标准有助于诊断，得到到广大病理医生的认同。值得大力推广。

参考文献

［1］ 胥维勇，杨群．脱钙方法与脱钙的选择及应用．中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11（3）：263．