免疫组化技术范文

免疫组化技术范文第1篇

【关键词】病理诊断 免疫组化 分析研究

【中图分类号】R36

【文献标识码】A

【文章编号】2095-6851（2014）04-0587-01

近年来，病理免疫组化技术得到了越来越广泛的应用，该方法可以极大地提高临床治疗效果，对于促进患者尽快康复具有积极意义。总体来说，该方式是目前组织标本制作方面比较理想的一种方式[1]。免疫组化作为一个综合性的操作技术，具有较多的反应步骤和较为复杂的影响因素，在进行操作时，要求技术人员充分按照规程进行，要不断加强全程控制。我院积极进行了实践，取得了一定的经验。具体情况如下。

1 免疫组化操作过程

1.1 固定标本 固定标本的基本作用，就是确保组织细胞本身形态完整，防止其发生负面变化。这一步是进行病理诊断的基础，对诊断结果的准确性和免疫组化的有效性均具有极为重要的影响。具体来说，要注意以下几个方面的因素：①在标本脱离本体后要立即进行固定，时间控制在15分钟以内。固定液采用比例为10%的中尔马林，其用量必须控制在标本的5-10倍。②要把握好标本的固定时间。手术离体标本固定时间一般为12-24h，最大限度为72h。研究表明，如果标本固定时间超过1周，将导致组织细胞抗原决定簇被覆盖，从而无法进行检测。③要注意准确把握固定液的种类以及浓度。进行免疫组化，一般采用浓度为10%的中性甲醛。固定液的浓度要保持一定的度，过高或者过低，都会对组织造成一定的影响，导致组织的有效成分丢失挥着无法实现准确的背景着色等，对最终结果造成不良影响。④在进行标本固定时要正确处理。比如，在固定淋巴组织时，要切开包膜，否则将会对固定液的渗透造成不良影响。有些大标本在进行固定时没有切开，将导致固定不均匀，从而影响染色效果。

1.2 切片、烤片与脱蜡 ①确保切片质量。有价值的切片不仅要薄，而且要完整。要确保将病变组织准确完整地切出来，才可以在染色的时候做到有的放矢。一般情况下，切片厚度大约为3-4um。②确保切片皱褶平整。如果切片边缘位置发生卷曲，则将导致试剂无法完全冲洗，每各阶段的试剂均可能在不平整位置残留，最后在显色时，这些地方着色效果就会受到严重影响，无法准确进行判断。③保证清洁。要确保所使用的水源一级器具均达到清洁要求，防止对切片造成的污染，影响最终效果。④控制好温度。烤片温度要适当，过低则无法实现效果，容易造成脱片，过高则对效果造成严重影响，使抗原丢失。一般维持65℃烘烤1小时就可以开始染色。⑤妥善脱蜡。脱蜡要把握好分寸，如果不彻底，蜡膜就将阻止抗体进入组织，影响最终效果。可以采用三级松节油，每级脱蜡8分钟，效果比较理想。

1.3 减少或清除非特异性染色 如果组织中非抗原抗体反应出现阳性染色，则属于非特异性背景染色。发生这一情况的主要原因是蛋白吸附在高电荷的胶原和结缔组织上。这种情况下，可应用0.3%的双氧水封闭。0.3%的双氧水作用比较缓和，不会影响染色以及抗原。

1.4 抗原修复 修复方法主要是加热。具体的工具包括高压锅、微波炉等。通过加热，对氢键进行修复，从而使组织中的抗原决定簇显示出来。高压锅热修复应用较多：先在锅中加入0.01M，pH6.0的柠酸盐缓冲液共计2000ml，加热直到沸腾，再放入切片，盖上并加减压阀。保持火源，在减压阀冒汽2分钟后熄火、冷却。再将切片取出进行下一步工作。

1.5 一抗的选择 大多数科室都使用的即用型抗体，值得注意的是不同公司的一抗作用是不一样的，就是同一家公司的抗体，也是有些效果好，有些效果差。这就需要多选择几家公司进行比较，择优使用。使用浓缩型的抗体的时候，在使用前，需要进行不同浓度配比实验，找到最佳浓度配比后才进行配置试剂。使用一抗后，我科建议切片在4摄氏度的冰箱内过夜。

1.6 显色 DAB显色液应当在使用之前进行配置，时间控制在30分钟之内。如果显色液发生棕色沉淀，则表明其已经失效。在对显色进行观察时，阳性部位较多的组织显色极为迅速，1-3分钟就会显示棕色，此时立即终止。阳性部位稀少的组织，则要借助显微镜进行观察，时间控制在10-15分钟。

1.7 复染 衬托免疫组化的阳性染色，使组织结构清晰易于观察。

2 免疫组化质量控制

2.1 保证染色切片质量 切片质量是影响临床判断的一个重要因素。在进行染色切片时，需要医生和技师的相互配合。医生要正确进行组织选取和对照设置，准确地对结果进行分析和进行技术指导；技术人员则要按照相应规范进行操作，确保其检测的精准度。

2.2 提高质量控制水平[2]在进行实验室操作时，必须按照既定的技术标准和操作流程严格执行。在进行固定时，要保证烤片时间和适当温度，要防止出现对抗原决定簇的破坏。试剂浓度要进行严格控制。为提高质量控制效果，要同时设立阳性、阴性以及空白对照。要确保抗原修复的一致性，准确控制好温度和时间以及修复液的酸碱度，同时要对抗体的阳性或者阴性进行准确判定。

3 讨论

病理免疫组化技术的用途日益广泛，这一方式可以极大地提高肿瘤诊断的准确率。在对患者进行诊疗时，还可以通过抗病毒、细菌、真菌以及寄生虫抗原的特异性抗体进行免疫组化染色，对疾病进行准确诊断[3]。在报告结果时，不能只是局限于解释结果，还要兼顾抗体特性和组织性质，并排除干扰因素[4]。在具体的操作中，由于技术原因，该方式还存在着一定的局限性。要实现最佳的效果，需要准确诊断和合理解释同时实现。因此，医生和技术人员在具体实践过程中，一方面要加强配合，另一方面要严格执行相应规范制度，尽量避免和缩小由于局限性导致的误差，增加诊断准确率。

参考文献

[1]张哲学.临床诊断中免疫组化技术的应用研究[J].中国民族民间医药，2011，12（6）：99-100.

[2]张雪昊.肿瘤诊断中免疫组化的临床意义[J].实用肿瘤学杂志，2011，11（9）：159-160.

[3]陈文.免疫组化在病理诊断中的应用分析[J].中国实用医学杂志，2011，9（5）：98.

免疫组化技术范文第2篇

【关键词】 自制免疫组化笔；中性树胶；免疫组化切片

【Abstract】 Objective To avoid organization overflow of antibody in immunohistochemical experiment, and get not incubation and reaction on antigen and antibody.Therefore, the experiment must use immunity group pen draws a circle periphery the slice organization avoids the immune body flowing out.Methods The old selfmade immunity group liquid stone wax pencil, pour into the 2ml gum with the vial, joins the right amount xylene dilution gum, dips the dilution after this pen the gum draws a circle periphery the slide organization.Results The result reaches 90% again using the selfmade immunity group pen's waterproofing rate, was the same with the American import immunity group pen and the domestically produced pen its waterproofing rate effect, strengthened the immunity group masculine cell's expression effect.Conclusion The spends the old selfmade immunity group pen definitely to be possible to replace any domestically produced, the import immunity group pen, and low in price.

【Key words】 Simple PAP pen;Neutral balsma; Immunohistochemistry

作者单位：519000广东省珠海市中山大学附属第五医院病理科

免疫组织化学技术是利用免疫学抗体与抗原结合的原理以及细胞化学技术对组织、细胞特定抗原或抗体进行定位定量研究的技术。它广泛应用于生物学、组织解剖学、病理学等［1］。做免疫组化不外乎两种方法:漂片法或贴片法［2］。然而，前者容易烂片，不适合做脑片等大而易碎的组织;后者方法较好，但为了保持良好的染色效果和节省抗体，常常需要免疫组化笔。免疫组化笔无论是国产还是进口，都有在使用过程中液体石蜡流出不畅或使用中用力过大导致液体石蜡流出过多污染片子，免疫组化液体石蜡笔使用到后期隔水性差，同时圈片数量有限，且价格昂贵。我们通过多次实验，摸索出一种废旧免疫组化液体石蜡笔的再利用技术，其防水性好、价格低廉、可保证免疫组化效果。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用品和器械 树胶2 ml(中国上海懿洋仪器有限公司)、废旧免疫组化液体石蜡笔一支、30张贴有脑片的载玻片(每张载玻片2张脑片)、0.05 m的PBS、各种抗体、MaxVisionTM试剂盒、DAB显色剂(AEC显色剂)(购于迈新试剂)、湿盒、恒温细胞培养箱、冰箱、普通显微镜等。

1.1.2 实验分组 实验分3组:甲组用美国进口免疫组化笔画圈;乙组用国产一般免疫组化笔(福州迈新公司生产)画圈;丙组用废旧免疫组化液体石蜡笔画圈。每组15张载玻片(30张脑片)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化笔的制作方法 将废旧免疫组化液体石蜡笔放入二甲苯中，将笔芯中残留的液体石蜡彻底溶解去除干净之后取出，这样就制成了一只再利用免疫组化笔。

1.2.2 免疫组化笔的使用方法 用小瓶倒入2 ml树胶，加入适量二甲苯稀释树胶，将再利用免疫组化笔蘸少量稀释后树胶围绕切片组织周围0.2 cm处画圈，树胶不能覆盖切片上的组织。

1.2.3 免疫组化MaxVisionTM法(试剂盒及抗体均购于福州迈新试剂公司)［3］。①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，3 min次。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。③如果有必要(内源性过氧化物酶含量过高的组织)，每张切片加一滴或50 μl 3%过氧化氢，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，3 min/次。④除去PBS液，每张切片加一滴或50 μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60 min或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次，3 min/次。⑤除去PBS液，每张切片加一滴或50 μl即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育10~15 min。PBS冲洗3次，3 min/次。⑥除去PBS液，每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3~5 min(DAB)或10 min(AEC)。⑦自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

1.2.4 结果观察及统计学处理 观察整个实验过程中再利用免疫组化笔的隔水性效果;镜下观察组织切片中抗原与抗体结合后抗原在免疫组化中阳性反应物的表达情况，将所得数据进行统计学处理、分析。

2 结果

2.1 3种免疫组化笔隔水率的比较 美国产免疫组化笔的隔水率为90%;国产免疫组化笔的隔水率为80%;而再利用的免疫组化笔的隔水率可达90%。

2.2 3种免疫组化笔对免疫组化试验阳性结果的影响 镜下大体观察发现:用再利用的免疫组化笔画圈的切片阳性结果良好，而用美国产免疫组化笔画圈的切片虽有阳性结果，但片子周围有时有污染现象。

3 讨论

我们在多次免疫组化实验中发现:市售的各种免疫组化液体石蜡笔有时会出现使用不畅，甚至根本画不出来，有时画片时稍用力过大，液体石蜡就会从笔芯中溢出过多污染切片，是影响免疫组化结果的因素之一，而且此笔价格昂贵，一杆国产笔价格大约在400元左右，画圈不超过200个笔芯中的液体石蜡即用完。为此，我们通过多方探索找到了理想的替代品:中性树胶。树胶是一种天然树脂，广泛应用于生物学、医学，作为生物切片的封藏剂，它可溶于二甲苯、苯、甲苯、二氧氯环等，不溶于水［3］。中性树胶中加入适量二甲苯稀释，可使树胶易浸入笔芯中，在切片上画圈时使之顺畅，同时二甲苯挥发后树胶画的圈淡且薄，但却不影响隔水效果。免疫组化组织切片染色后需用中性树胶封片，封片用的树胶与画圈用的树胶相互溶合，不会形成污染。故此，我们应用其特性再利用了废旧的免疫组化笔，在实验中不但节约了大量的资金，而且使用方便耐用，3 ml 树胶可画300个圈左右，代价大约只有2元钱。最重要的是它不影响免疫组化结果，由于隔水性能好，保证了抗原抗体的充分结合，增强了免疫组化的效果，节约各种抗体及试剂盒各试剂，故可推荐使用。

参 考 文 献

［1］ 李成文.现代免疫化学技.上海：上海科技出版社，1992：97100.

［2］ 朱长庚.神经解剖学.第4版.北京:人民卫生出版社，2002：87.

免疫组化技术范文第3篇

【关键词】细胞学；薄层液基涂片；染色；方法

【Abstract】objective:tostudythin-layerliquid-basedcytologysmeartechniqueanditsapplicationinImmunohistochemistry.Method:theuseofcomparativesignificanceoftwogroupsofcases.Therewere74casesofadenocarcinomainpleuralfluid-basedsmear.40casesofsmallcell,resolvingphlegmandsmear.Secondgenerationusingimmunohistochemicaltwo-stepdye.Results:adenocarcinomainpleuraleffusionandascitesinathinlayerofliquidbasedsmearsadenocarcinomacellsonCEAantibody-negative,Mesothelialcellstomesothelin(mesothelin)antibody-positivesmallsmallcellundifferentiatedcarcinomacellandresolvingphlegmsmearonCHAantibody-positive.OnLCAantibody-positivelymphocytes.Conclusion:ImmunohistochemicalAntigen-antibodyreactionisahighdegreeofspecificityandsensitivityofbiochemicalreactions,toaspecificantigenrecognitionandstrong.Incells,subcellularleveldetectionAntigenmoleculeisdifficultforotherbiotechnologyandalternative.Onthecytologyhasbroadapplicationprospects.

【Keywords】Cytology;thinlayerliquidbasedsmears;dyeing;method.

【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0308-02

免疫组化是用特异性抗体对细胞或组织内的抗原进行定性、定位或定量检测。凡能作为抗原半抗原的物质，都可用免疫组化方法检测，近年免疫组化技术在病理组织学上广泛应用，但少见于细胞学薄层液基涂片的报道。本文总结细胞学薄层液基涂片的免疫组化染色实验，探讨免疫组化技术在细胞学上的应用。

1材料与方法

1.1材料：选用有对比意义的细胞学检材，记有腺癌性胸腹水薄层液基涂片74例，小细胞未分化癌涂片40例，试剂选用迈新公司Elivsionplus免疫组化试剂盒。

1.2方法：免疫组化二代二步染色法：1）胸腹水、痰薄层液基涂片、固定、潮干、PBS液洗涤。2）胰酶消化修复抗原，胶酶浓缩剂与稀释液按1:3滴加，37℃孵育15分钟，PBS液洗涤。3）阻断：滴加3%过氧化氢液，37℃孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS液洗涤。4）免疫反应，抗体依需要自选，滴加后37℃孵育1小时，PBS液洗涤。5增强反应，滴加增强剂，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤.6）标记：滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤。7）显色，滴加新制DAB液，镜下观察，显色适当后放入蒸馏水中终止反应。8）苏木素复染，中性树胶封固。

2结果

经反复实验总结出以上染色方法，可使阳性细胞液基涂片中的阳性细胞呈黄棕色或棕褐色。74例腺癌性胸腹水离心涂片中，变形未圆形、卵圆形，聚集成团的深染的腺癌细胞，与增生间皮细胞在镜下难以区别；通过免疫组化染色，腺癌细胞对CEA抗体显阳性，间皮细胞对mesothelin（间皮素）抗体显阴性。40例小细胞未分化癌痰涂片中，小细胞未分化癌细胞略大于淋巴细胞，圆形、卵形、短小梭形，核深染，与大淋巴细胞难以鉴别。通过免疫组化染色，小细胞未分化癌细胞对CHA抗体显阳性，淋巴细胞对LCA抗体显阴性，这样可以鉴别开来。

3讨论

免疫组化技术范文第4篇

【摘要】目的,探讨液基细胞学薄层涂片技术在体液免疫组化中的应用。方法对经巴氏涂片检查发现癌细胞的胸腹水36例分别采用液基细胞学涂片技术和传统涂片方法涂片，然后进行免疫组织化学检查。结果,采用液基细胞学薄层涂片技术制作36片，优质片36片，其优片率100%；采用传统涂片方法制片36片，优质片30例，其优片率83.3%，两者间差异显著。结合免疫组化结果有助于诊断和鉴别诊断间皮瘤和腺癌，结论,采用液基薄层细胞学涂片技术制片提高了制片的质量，对间皮瘤和腺癌的诊断和鉴别诊断提供了有效的方法，提高了脱落细胞学对间皮瘤和腺癌的诊断价值。

【关键词】活组织检查；细胞学技术；免疫组织化学；间皮瘤/诊断；腺癌/诊断

在体液细胞学检查与诊断研究中，涂片及染色质量的好坏直接影响到病理诊断及研究结果的正确判断，而免疫组化结果有助于诊断和鉴别诊断间皮瘤和腺癌。传统的巴氏涂片在免疫组化质量上不能令人满意，如细胞重叠，色调不正、杂质多等，而我科在工作中经过不断的摸索，发现了液基细胞学薄层涂片技术应用于免疫组化中，获得了较满意的效果。

1、材料与方法

1.1材料来源：我科2010—2011年间以经巴氏涂片检查发现癌细胞的胸腹水36例，其中男20例，女16例，年龄35～80岁。所有病例都有手术标本的组织学对照，排除了肿瘤者为阴性病例。

1.2方法：新鲜胸、腹水250～500ml，留置时间复季＜2h，冬季＜4h。

1.2.1胸、腹水沉淀与固定将胸、腹水置于2个50ml的离心管中，每管50ml，2000～2500r/min离心10min，弃上清液，吸出部分沉积物常规涂片，剩余沉积物稀释后直接加入装有低浓度乙醇细胞保存液的保存瓶内备用，在保存瓶内至少放置15min以上。然后经thinprep-2000系统进行电脑程序化处理，制成直往为13mm的薄层细胞涂片（制作免疫组化涂片时，液基薄层制片机的染料临时用95%的无水乙醇代替），自然干片后，按常规免疫组织化学染色，封片、读片诊断。

1.2.2免疫组化用ElivisionTMPlus法。抗体有CEA、Calretinin、Cytokeratin5/6、CD68，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

2、结果

采用液基细胞学薄层涂片技术制片36片，优质片36片，其优片率100%；采用传统涂片方法制片36例，优质片30例，其优片率83.3%，两者间差异显著。

3、讨论

液基细胞学检测是90年展起来的一项制片新技术，已成功的应用于妇科细胞学，并取得了成熟的经验。目前已经广泛用于宫颈癌的筛查，但在体液免疫组化中应用甚少。胸腹腔积液在常规细胞学检查中仍然是目前临床常用的诊断方法之一，传统的巴氏涂片法在体液的肿瘤细胞筛查上应用已超过半个世纪，但容易出现漏诊或误诊，主要原因是其标本的制作往往受到体腔积液的新鲜程度、细胞数量、退变程度、血细胞含量或炎细胞干扰、黏液过多涂片厚薄，固定状态等多方面因素的影响，造成涂片质量差，导致较高比例的假阴性率，假阳性率出现或干扰因素多导致免疫组化结果无法准确判读［1]，有作者认为背景中血细胞的多少与涂片质量有明显的关系，血细胞越多，往往有核细胞成分则少见，癌细胞也稀少，单个存在或不典型［2]。本文选用的液基细胞学薄层涂片技术对标本采集，制片技术及程序比传统涂片具有以下优点［3]：（1）通过离心，细胞均匀涂布形成一个直径13mm的细胞薄层，结构清晰，背景干净，改变手工涂片细胞拥挤、重叠，形态特点不易观察的缺点；（2）避免了细胞过度干燥造成的假象；（3）可以同时处理1～48份标本，并在全自动制片过程中同时完成细胞染色，也减少技术员对标本的接触。

传统的制片方法是将体腔积液离心后直接涂在普通的玻片上。这种涂片质量常不稳定，涂片厚薄不均匀，细胞重叠较重，而背景中又有较多的蛋白黏液，红细胞和各类炎细胞及间皮细胞相混杂在一起，影响细胞的观察，有些异常细胞甚至被遮盖，这些都容易影响诊断的准确性［4]。而液基细胞学薄层涂片几乎保留了离心后的所有细胞,并均匀分布于玻片上，去除了黏液、红细胞、炎细胞的干扰，肿瘤细胞形态保存完整、细胞核、核质、核仁更清楚，获得了三维立体结构。此外，标本储存在保存液中，可重复制片，抗原性不受影响，也可用来作特殊染色，采用液基薄层细胞学涂片技术制片提高了制片的质量，对腺癌和间皮瘤的诊断和鉴别诊断提供了有效的方法，提高了脱落细胞学对腺癌和间皮瘤的诊断价值,与传统制片方法相比，液基细胞学薄层涂片用于免疫组化中还节约抗体量，从而节约成本,值得推广应用［5]。

参考文献

［1]梁昌杰，吴秋良，梁小曼等.胸水涂片肿瘤细胞学诊断.广东医学，2001，22（11）：1046.

［2]杨霞，姚宇琪，王娟.液基细胞学（LPT）在体腔积液检查诊断中的应用［J]，中国实验诊断学，2009，13（2）：194-196.

［3]谢寿城，液基细胞学薄层涂片技术对宫颈疾病诊断中的应用价值［J]，中国实用医药，2010，1（5）：31—32.

［4]董卫彤，覃志坚，潘兴寿等，胸腹水细胞学与组织学制片的免疫细胞化学诊断对比研究［J]，江西医学检验，2006，24（1）：17—18.

［5]岳巧艳，袁捷。腹腔积液细胞学检查的研究进展［J].实用癌症杂志，2009，24（6）：678—679.

免疫组化技术范文第5篇

[关键词] 彩色多普勒超声;膀胱癌;多发;阻力指数;新生血管

中图分类号:R445文献标识号:A文章编号:1005-0515(2010)09-046-02

【Abstract】 Objective To study the significance of angiogenetic activity examined before operation and investigate the relationship between angiogenetic activity and pelvic lymph node in human multiple bladder cancer. Methods Vascularizations of bladder cancer from 21 cases were observed by Color Doppler flow image to measure resistance index (RI).The microvessel density (MVD) of the biopsy specimen of the bladder cancer obtained before and after operaion was assessed by immunohistochemistry. Results The value of RI of pelvic lymph node metastasis group (LM+ group) was much higher than that of no pelvic lymph node metastasis group (LM- group) (P

[Key Words]Color Doppler Ultrasound bladder cancer multiple resistance indexangiogenesis

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,如美国2002年有56500例新诊病例[1]。其中以膀胱移行细胞癌多发(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)[2]。肿瘤发生时,瘤灶及瘤周将会发生持续的、失控的血管生成;恶性肿瘤的发生、发展及转移的各阶段均有赖于新生血管的形成[3]。淋巴是肿瘤细胞转移的重要途径,50%以上的肿瘤细胞经淋巴转移。盆腔淋巴结是膀胱癌最主要的转移部位[2]。我们应用彩色多普勒血流显像技术(CDFI),结合免疫组化方法分别检测多发膀胱癌术前活检组织和术后肿瘤组织内微血管密度(MVD),探讨检测膀胱癌血管生成活性及与盆腔淋巴结转移的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择本科2005年5月至2008年7月住院治疗的多发膀胱癌患者21例,术前均未行放疗及化疗,术后病理证实为BTCC,G1、G2、G3期肿瘤分别为5、10、6例;Ta、T1、T2期肿瘤分别为4、11、6例。其中男15例,女6例,年龄51―83岁,平均63.5岁。均行膀胱全切加盆腔淋巴结清扫术,根据情况行肠代膀胱或输尿管皮肤造口。术后病理检查伴盆腔淋巴结转移者(LM+组)6例,无淋巴转移者(LM-组)15例。

1.2 主要试剂

多克隆羊抗小鼠CD31抗体,即用型HIGH-SABC免疫试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 CDFI检测膀胱癌血流

所有病人术前应用美国Gsteway Series型彩色多普勒超声诊断仪,探头频率7.5 MHz,二维切面观察膀胱大小、形态、内部回声及边缘情况。CDFI多切面观察肿瘤内部及周围血流,于血流显示最明亮处行脉冲多普勒取样,获稳定频谱后停祯,自动显示阻力指数(RI)数值,分别侧3条不同血管,采用最小RI值,界定值取0.40[4]。

1.4 免疫组化染色

术前膀胱镜活检组织和术后切除肿瘤组织标本分别用10%甲醛固定,石蜡包埋,应用SABC免疫组化法。采用多克隆羊抗小鼠CD31抗体,即用型HIGH-SABC免疫试剂盒,每一标本取两张4 μm厚石蜡切片,具体操作步骤参照CD31抗体和即用型HIGH-SABC免试剂盒说明书。PBS代替一抗做阴性对照,阳性对照为肿瘤包膜血管阳性染色。DAB显色,苏木精复染,树胶封片。使用Nikon照相显微镜,先在低倍光镜下(×100)将整个切片扫视一遍,选择出微血管生成(棕黄色染色)最多的区域,即血管生成热区,然后换至高倍光镜下(×200)计数血管生成热区中的CD31染色的所有血管内皮细胞[5]。每一组切片由两位观察者各自选择3个血管生成热区,共计数6个血管生成热区中的平均血管数,再除以每高倍光镜视野下的面积(0.015 mm2),即为MVD值。

1.5 统计学方法

应用t检验和直线相关性分析,P

2 结果

2.1 CDFI检测RI值

所有患者术前CDFI检测均得到满意的血流频谱。LM+组RI值≤0.40 5例(5/6,83.3%),LM-组RI值≤0.40 4例(4/15,26.7%)LM+组与LM-组的RI值比较有显著性差异(P

2.2 LM+组和LM-组术前活检与术后肿瘤组织内MVD比较

肿瘤微血管内皮细胞的细胞膜呈棕黄色着色为CD31染色阳性,微血管分布呈明显异质性,微血管丰富区多位于肿瘤边缘。6例LM+组术前活检组织MVD和术后肿瘤内MVD值均明显高于15例LM-组,差异有显著性(P0.05),见表1。

2.3 患者术前RI值与术后MVD计数的相关性分析

所有患者术前CDFI检测RI值与术后肿瘤组织内MVD计数有良好的负相关性(P

3讨论

肿瘤的生长依赖氧气和其他营养物质;早期主要依靠细胞的弥散方式获得氧气和其他所需营养物质,但这样的肿瘤结节直径不会超过2mm-3mm,细胞数小于107。如果没有进一步的血管生成,肿瘤细胞将因缺乏氧和其他营养物质而处于休眠状态。所谓肿瘤细胞休眠状态并不是指肿瘤细胞不再分化、增殖,而是肿瘤细胞增殖被同等速率的细胞凋亡所平衡。不过一旦肿瘤细胞获得血供,肿瘤细胞的增殖速率将大大超过凋亡速率,肿瘤便加速生长,且易发生浸润和转移[6]。MVD检测是反映血管生成状态的金标准[7]。CDFI技术能简便、直观检查肿瘤内血流信号。我们的实验结果显示CDFI检测的RI值在多发膀胱癌盆腔转移组与无转移组之间差异有显著性,提示CDFI对膀胱癌组织内血流检测可能为临床判断膀胱癌盆腔淋巴转移和预后提供一种较为简便的形态学指标。

BTCC初发时70-80%为表浅癌,其余20-30%往往发展为侵袭性和转移性癌。表浅癌术后60%以上复发,10年内42%肿瘤向高期、高级进展[8]。高发病趋势及易复发进展的特性决定了早期诊断和术后合理有效治疗的重要性。与大多数恶性实体肿瘤一样,BTCC的发生发展依赖于血管生成[9]。已有学者研究认为恶性肿瘤内MVD与肿瘤转移和预后具有高度相关性[10]。我们的研究结果显示多发膀胱癌术前活检组织和术后肿瘤组织MVD差异无显著性意义,膀胱癌术前活检组织和术后肿瘤组织中的MVD LM+组明显高于LM-组,提示微血管密度在判定膀胱癌生物学行为方面的一个独立指标,临床可采用术前活检肿瘤组织MVD预测膀胱癌盆腔淋巴转移和预后。

目前CDFI技术已较广泛应用于临床,我们的实验结果提示通过对肿瘤内部血流定量检测可以间接评估肿瘤内血管生成活性,将其与术前活检组织的MVD检测相结合,可以更好的评估多发膀胱癌内血管生成活性与转移预后等,而且对术中是否清扫盆腔淋巴结有指导作用。

参考文献

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免疫组化技术范文第6篇

[关键词] 免疫组化; 质控; 病理; 医技人员; 沟通交流

[中图分类号] R446.8 [文献标识码] C [文章编号] 1673-9701(2009)23-121-02

免疫组化是目前病理诊断方面广泛应用的新技术,在病理诊断鉴别肿瘤中起重要作用,也是指导临床肿瘤治疗和判断肿瘤预后的重要依据[1]。免疫组化发展较快,染色结果受多种复杂因素影响以及病理诊断和病理技术二者均充满个性化,颇具经验型,难以标准化,造成目前免疫组化质量难以令人满意[2],免疫组化结果的可靠性,准确性引起了业内极大的关注。因此,强化病理实验室免疫组化质控成为当前病理学科发展的迫切要求[3] 。

1 质控中医技人员沟通交流的重要性

1.1 对免疫组化质控的正确理解是基础

免疫组化染色结果受制片因素、染色方法、染色流程、试剂质量、实验室条件等综合因素影响。同一种抗原可以在多种肿瘤或组织中表达,没有一种完全针对某一肿瘤或组织的特异性抗体,也给免疫组化染色结果的正确判断带来困难和一定局限性。免疫组化结果判断的正确性和可靠性体现病理医技人员综合水平[4]。免疫组化具有非常强的技术性和实验性特性决定了要做好免疫组化确实不易。强化免疫组化质控,使免疫组化操作逐步规范化、标准化、正规化,对切实提高免疫组化染色质量,同时促进和提高病理实验室质量管理水平具有很重要的现实意义。

1.2 沟通交流是做好免疫组化质控的现实需要

目前,欧美发达国家免疫组化质控有一套比较先进的方法和程序,国内免疫组化质控方法正处于摸索之中,免疫组化质量尚未形成一个权威性标准。在免疫组化标准化欠缺足够重视、免疫组化质量参差不齐的状况下,面对多种复杂因素影响的免疫组化染色结果,要做好免疫组化质控工作必须依靠病理医技人员通力合作。病理医生和技术人员历来关系微妙,如果都站在各自立场上,很难客观正确解读清楚免疫组化染色结果现象如染色结果表达与不表达,该不该表达的真正意义和原因,免疫组化染色结果可靠性将会受到影响。因此,在免疫组化室内质控和室间质控中非常需要加强彼此之间沟通交流,发挥诊断医生主导作用,改变诊断医生只关心染色结果、技术人员只管技术操作的现状[5],实事求是综合分析判断整个免疫组化制片过程、染色过程、正确评估染色结果,从而促进免疫组化规范化和标准化,提高免疫组化病理诊断的质量和水平,和谐病理医技人员关系。

2 做好医技人员沟通交流的关键

2.1 相互理解和尊重

一般情况下,病理医生关注的只是免疫组化染色结果,对染色结果判断体现医生业务水平。技术人员是免疫组化实际操作者,理论水平不足,操作受各种技术条件因素影响较大。医技人员相互之间应该尊重,不要各自从专业技术解读染色结果,应该站在对方角度理解各自专业的能力和局限。大家要充分认识到:做好免疫组化质控,提高免疫组化质量对病理医技人员都必须有一个认识过程和经验积累过程,正确解读免疫组化染色结果也需要有一个不断认识过程,并且这是一个相互促进的过程。一些单位开展免疫组化质控但效果不明显,很大程度上是医技人员之间的理解和尊重问题以及出现问题后双方之间缺乏有效的沟通交流。医技人员之间相互理解和尊重应该是做好免疫组化质控的最关键因素,相互之间有效沟通交流是做好免疫组化的现实基础。

2.2 提高专业水平

专业水平不高,难以沟通。免疫组化发展较快,试剂种类增多、染色方法改进、操作流程更新,理论观念变化都需要病理医技人员加强学习。专业素质提高了,对染色结果原因有了客观理解和正确评估,更有利于病理医技人员做好免疫组化质控,提高免疫组化质量,认识免疫组化机制,有效发挥免疫组化在病理诊断和指导临床肿瘤治疗中的积极作用,共同推动免疫组化的不断进步和发展。

3 医技人员有效沟通交流的方法和技巧

3.1 建立免疫组化工作单加强室内质控

免疫组化工作要标准化,需要有严格的质量控制。病理医技人员要根据自己实验室具体情况共同讨论制定免疫组化工作单内容,将制片程序[6]、试剂类型、染色方法、操作程序、适合的质控对照和实验条件细化列入室内质控免疫组化工作单,每次操作中都认真实时记录,客观反映免疫组化染色全过程,给医技人员正确判断染色结果,分析结果原因和总结经验提供客观依据和方向,为尽快找到一种较好的、标准化的免疫组化染色方法,摸索出一种适合本实验室免疫组化质量控制的方法[7]打开思路。避免医技人员之间对染色结果缺乏依据猜测引发误解,营造科室宽松的学术氛围和正常和谐的专业技术反馈机制。在做好免疫组化室内质控中,摸索最佳抗体和染色流程、最佳实验室条件以及结果正确分析和问题原因查找更需要医技双方坦诚交换意见和建议。

3.2 参加全国免疫组化质控网活动搞好室间质控[8]

全国免疫组化质控网通过病理专家和试剂公司技术专家对统一分发切片的染色效果按照免疫组化质控标准测评,找出普遍存在问题,提出改进意见,推荐最佳抗体和染色流程,为免疫组化染色规范化起到了很好的促进作用,参加的单位都得到较大提高。争取参与其中室间质控活动,了解专家对本单位免疫组化染色结果的评估,分析本单位与优秀实验室的质量差异,病理医技人员可以明确知道本单位免疫组化染色结果真实情况,找到准确解读染色结果的方法,在较高技术层次对比中找差距,分析原因,学习和借鉴国内外好方法好经验,不断改进操作提高免疫组化质量。这些无论对诊断医生还是技术人员在免疫组化规范化学习方面都是最便捷、提高最快、效果最明显的好方法。

病理医技人员之间相互沟通交流是打开免疫组化质控的一扇窗户,效果取决于病理医技人员共同努力,效应体现在免疫组化质量上。

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免疫组化技术范文第7篇

【论文摘要】近年来分子生物学技术以及其它高、新技术在病理领域得到广泛的应用，同样作为体育界的基础研究学科运动人体科学的发展已经不能满足简单的宏观的研究，越来越多的医学检验以及病理学实验技术在运动人体科学广泛应用，尤其是组织病理学技术中定位技术，例如免疫组化、原位杂交等。本文就以上三种病理学常用的定位技术的方法进行综述。

1免疫组织化学实验技术

随着免疫组织化学染色技术的广泛应用，病理学研究产生了划时代的飞跃。免疫组织化学是病理学实验中常用的方法，是在蛋白质水平用各种特异性抗体检测细胞内各种抗原物质。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。

1.1免疫组织化学实验步骤免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术。其原理是利用免疫学的核心——抗原体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的[1]。

1.2免疫组化技术的优点免疫组化技术的优点：①特异性强，免疫组化中抗体与组织细胞中的抗原的结合是特异的。如白细胞共同抗原（LCA）显示淋巴细胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素—生物素（ABC）法和链酶素—过氧化物酶连接（SP）法的出现，使抗体的稀释度(代表敏感度)达到了上千、上万，甚至上亿倍，使免疫组化技术更加可靠。③定位准确，由于抗原抗体的结合是特异的，因而免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位，对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，将形态与功能相结合，对疾病进行深入的研究。

2原位杂交实验技术

原位杂交是将组织化学与分子生物学技术结合来检测合定位核酸的技术。它是用一段已知序列的核苷酸片断来检测细胞内是否存在欲检测物质的DNA或RNA，是比免疫组化更加灵敏而深入一个层次的检验方法。根据所选探针和待测靶序列的不同，核酸原位杂交有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交等。

2.1原位杂交技术的应用原位杂交由于不需要从待测组织中提取核酸，可完好的保存组织、细胞的形态结构，将形态学与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。主要应用：①细胞特异性mRNA转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②感染组织病毒DNA/RNA的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的监测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染色体的变化；⑥间期细胞遗传学的研究。

2.2原位杂交技术与免疫组化的比较

2.2.1两者的区别原位杂交与免疫组化染色技术相比较，这两种方法的共同之处均具有定位检测的功能，且均有较高的敏感性和特异性，所不同的是免疫组化染色是用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；原位杂交使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待测靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。从实验方法来看，免疫组化染色操作相对简单，成本相对较低，受外界因素的影响相对小；原位杂交技术无论从实验设计上，还是从实际操作上均较免疫组化染色复杂，成本的高低与试剂的种类和来源密切相关。一般而言，直接选用商品化的标记探测和检测试剂盒的实验成本较高；荧光标记探针较非荧光标记探针的成本高，对样本及实验条件的要求较高，也更容易受到外界因素的影响。

2.2.2免疫组化与原位杂交双标技术双标技术是在同一张组织切片上标记两种不同的抗体或同时应用两种不同的检测手段，如免疫组化和原位杂交技术，在不同层次来检测同一细胞上某些物质的表达是否有相关性的一种实验方法。与传统的单项检测相比，双标记具有无可比拟的优越性，可以克服由于切片间各种差异而引起的时间或空间的样本误差。实验方法上先进行原位杂交会减少免疫组化过程中对待测DNA或RNA的破坏或影响，一般目前均推荐先进行原位杂交后进行免疫组化标记[2，3]。具体的操作跟单纯的免疫组化和原位杂交各自的方法一致。需要注意的问题就是：①所用的实验设备必须经DEPC水浸泡或200℃烤箱过夜，操作时须带口罩及手套；②当杂交步骤完成后，切片必须认真浸泡及长时间洗涤至少超过30min。③作免疫组化的各步骤时间均须适当延长，以增加抗原抗体间的结合，杨青春等人研究发现每个步骤均延长2～3倍时间。④免疫组化显色后不需要用苏木精复染，以免遮盖核信号。

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免疫组化技术范文第8篇

[关键词] 免疫组化；质量控制；标准化管理

[中图分类号] R446.8 [文献标识码] C [文章编号] 1673-9701（2013）31-0134-03

免疫组化染色技术在现代病理诊断中的应用日益广泛， 对各类肿瘤的确诊及鉴别诊断具有重要意义，而且在肿瘤患者个体化治疗、靶向治疗方案的选择及预后判断方面越来越受到临床医生的青睐，已经成为病理诊断中不可或缺的辅助手段[1]。因而很多单位，包括基层医院也开展了这个项目。随之而来的是，免疫组化质量控制问题也凸显出来了。这其中有实验员操作不当的因素，也有其他的因素，如组织固定不好、试剂效价和试剂盒质量问题等等，各免疫组化实验室质量管理水平参差不齐[2，3]。目前国内尚无免疫组化标准化管理的统一标准，因而在众多繁杂的条件中，探索找到一个相对稳定的免疫组化质量控制的条件，即所谓的标准化管理方法具有重要意义。笔者根据本科室的实际情况，总结免疫组化室内质控管理的一点心得体会，从实验前、实验中、实验后三方面浅谈免疫组化室内质量控制如何实现标准化管理。

1实验前的标准化管理

1.1 组织处理的标准化

组织处理得当是成功制片的关键，对免疫组化染色结果的影响尤其重要，主要包括取材、固定、脱水等环节。如果组织处理不良，那么在其后的任何阶段均难以补救。组织或细胞固定的目的是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性或内源性酶的反应，防止细胞自溶，以保持组织细胞的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，防止抗原的丢失或弥散。因此，标本应尽可能保持新鲜并及时进行固定。我们科室积极与临床一线沟通，宣传固定的意义、方法和要求，拟定以下标准：手术标本离体后30分钟内，用10%中性缓冲福尔马林固定。固定时间为小标本6～12 h，大标本12～24 h。组织取材厚度为3～4 mm，放入全自动脱水机进行脱水[4]。组织处理不好对抗原修复也产生影响，热修复时脱片的概率将会增大。

1.2 免疫组化切片的标准化

1.2.1 玻片处理及切片厚度 用于免疫组化的玻片一般都需要进行防脱片涂胶处理，目前常用的有氨丙基三乙氧基硅烷和L-多聚赖氨酸，防脱片的效果对比其他粘附剂都要好[5]。我们采用的是L-多聚赖氨酸，效果很好。采用3～4 μm连续切片[6]，切片厚度不能过于求薄，太薄由于抗原的减少，会导致抗体阳性表达的减弱，也不宜太厚，太厚在热修复过程中容易导致脱片。

1.2.2 抗原修复方法 福尔马林固定组织导致组织中抗原决定簇封闭，也就是组织细胞经福尔马林固定后，导致抗原决定簇的三维结构发生异常改变，使抗原决定簇被掩盖或原来位于表面的一些抗原决定簇因折叠而形成隐蔽的抗原决定簇，因此抗原的理化性质发生了显著的变化，表位空间结构改变导致许多抗原免疫活性丢失。但这一变化是可逆的，可通过抗原修复。目前抗原修复有两种方法：酶消化法和热修复法。

抗原修复方法的选择关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色结果有很大影响。有很多文献比较了各种抗原修复方法的优劣，目前，被认为效果最好、最常用的修复方式为高压加热修复[7-9]。我们将微波加热与高压加热的方法进行比较，发现阳性定位于细胞核的抗体，如P53、Ki-67等的核表达，在高压修复后明显强于微波修复，因此我们选择高压加热修复，抗原修复液为柠檬酸盐，修复时间为高压锅出气后2 min自然冷却，时间过短，抗原暴露不够，时间过长，导致背景过深。

1.2.3 抗原修复液的选择 加热抗原修复缓冲液有多种如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、Tris（pH7～8）、EDTA（pH8.0）等，目前首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背景清晰， 适合于大多数抗体。Tris和EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果。值得注意的是，没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适于用EDTA和Tris缓冲修复液。一般抗原比较难于表达的抗体多选择后两者。

1.3 试剂管理的标准化

1.3.1 试剂清单及使用记录的管理 试剂的种类、公司有很多，为了方便管理，我们创建了一个“免疫组化试剂登记表”Excel电子表格，进行试剂清单的管理，简洁又规范（图1）。登记表的内容包括抗体名称、类型、稀释度、是否修复、克隆号、编号、批号、公司名称、库存量、有效期、接收日期、启用日期、用完日期等，也可以根据各单位实际情况自己添加内容。所有试剂应保证在有效期内使用，只有这样才能确保抗体的效价。因此，登记表中有效期、用完日期的记录要求完整准确，过期试剂或者失效试剂应丢弃不用，并备注原因。每种试剂的使用情况都要记录在案（图2），与图1表格建立超链接。下图1为本科室免疫组化试剂登记表部分的截图，利用Excel条件格式将不同字体颜色显示不同指代意义，如红色提示超过有效期等。

图1 免疫组化试剂登记表（部分）

图2 试剂盒使用记录表（图1中超链接）

1.3.2 冰箱温度控制及试剂的摆放 所有的试剂均应在试剂公司建议的温度下保存，储存试剂的冰箱应每天检查，建立一个冷藏冰箱温度监测表，并按时记录温度值。不管是浓缩型还是即用型试剂，如果是一堆地放在冰箱里，要用或配置的时候找起来比较麻烦费事，我们自己设计制做了几个试剂摆放的木架子，将免疫组化试剂按首字母AZ排列，同系列的按数字从小到大依次排列，如Actin、AFP、Bcl-2、CA125、CD10、CD117等依次排列（如图3所示），这样找试剂比原来方便许多，节省时间，看起来也比较整洁。

图3 试剂的摆放

图4 阳性与阴性对照

1.3.3试剂配置 免疫组化的试剂分为即用型和浓缩型两种，浓缩试剂的配置，需要对抗体滴度（稀释比）进行评估。我们参考公司推荐的抗体滴度，在其前后各增加一个实验滴度，如公司推荐1∶200，我们配置1∶100、1∶200、1∶400三种滴度，进行预实验，以观察阳性细胞染色强度及非特异性染色，验证试剂的可靠滴度，然后才能在常规的实验中应用。

2实验中的标准化管理

2.1 检测方法的选择

免疫组化的检测方法有很多种，大致分为生物素型和非生物素型两大类。因组织中含有内源性生物素，所以会干扰免疫组化的染色结果，在生物素型检测方法的操作过程中，要阻断内源性生物素干扰。非生物素型聚合物检测，可以有效地防止内源性生物素的影响，并且灵敏度高，操作简便，为很多实验室采用，是目前免疫组化标准化染色的首选方法。我们采用的是非生物素型EliVision二步法，检测方法比较稳定，效果也好。

2.2 免疫组化染色操作标准化

目前，免疫组化染色分手工操作和全自动免疫组化仪操作。在手工染色过程中，或多或少要受到实验员个人因素的干扰。全自动免疫组化仪的出现，避免了操作过程中人为因素的干扰，增加了染色结果的可靠性，有助于免疫组化质量控制的标准化管理。我们采用全自动免疫组化仪进行染色，与手工染色相比，具有以下技术优势：①精确的抗体孵育时间控制，确保染色质量，避免背景非特异性着色。②精确的抗体浓度以及量的控制，避免因实验员手法不同而导致抗体浓度被稀释，影响染色强度的表达，还可以避免交叉污染和非特异性染色的产生。③二维码的识别，可以使滴加试剂的时候不会产生滴错的现象，避免人工滴加错误，导致假阴性或假阳性结果的发生。④可根据实验员的工作需要，统筹安排，能更加合理高效地利用时间。⑤程序结束后可以保存整个进程，如果出现问题，可以在实验结束后复审，以便查找出问题的原因[10]。

2.3 阳性与阴性对照

每一次免疫组化染色必须严格设立阳性对照和阴性对照[11]。我们的方法是，每个抗体都备有一个阳性对照的小蜡块，阳性对照小蜡块的准备：取材的同时，从大体标本中重新取材，制作成大小约为0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm的组织块，一起脱水包埋。时间应控制在48 h之内，用以保存组织抗原；常规HE切片染色，镜下观察有癌组织后，进行所需抗体表达测定，评估适合作为阳性对照后放置备用。阳性对照小蜡块主要目的针对试剂的不同批次、重新配置、滴度预试验等，用来评估试剂的可靠度。在实验过程中将待测组织与阳性对照小蜡块组织裱于同一张切片（图4），PBS代替一抗作为阴性对照，然后进行染色，实验结果更可靠、更节约成本，这一方法值得推广应用。

3实验后的标准化管理

3.1 染色结果判断的标准化

免疫组化切片应是阳性标记强而非特异性染色淡或无，两者形成鲜明的对比，阳性表达必须在细胞或组织特定的部位，细胞边界清楚；每批染色都要有阳性对照、阴性对照和自身对照才能对染色结果作出正确判断。判断标准常根据阳性细胞的百分比或阳性细胞的染色深度来判断，其颜色深浅反映抗原量的多少。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。阳性反应分布总是有规律、局限、定位准确和一定形态特征的，如细胞膜着色呈圆形；典型的细胞核着色为均质状，核仁和染色质呈颗粒状着色。细胞浆呈颗粒状（位于细胞器）或纤维状（中间丝或微丝）或弥漫片状（细胞内液、病毒颗粒及吸收蛋白）着色；细胞间质呈纤维条块状着色；若阳性结果定位异常象征着疾病过程。非特异性着色为无规律、无界线、定位不准确且不能重复；结缔组织受染和内源性生物素干扰是最常见的非特异性着色，镜下为均匀细颗粒状的浅棕色，但不会出现在细胞膜或细胞核。

由于免疫组化染色结果是定性指标，不能定量，染色结果判断受到诊断医师的主观因素影响而导致结果差异。为了减少这种差异的发生，我们科室内部采用统一的免疫组化染色结果判定标准，严格按照公认的分级标准进行判定，如乳腺癌ER、PR采用Bessley分级法[12]，C-erbB-2采用美国临床肿瘤协会（ASCO）/美国病理学家学院（CAP）HER2检测指南等[13]。

3.2 实验结果的跟踪、记录

每批次的免疫组化结果，进行质量跟踪记录，对于特别异常的结果，应该分析原因。是新购试剂，还是新配试剂，或者是操作过程中有无异常；全自动免疫组化仪染色的可以把程序调出来复审，然后备注分析的原因，重新设立阳性对照再染色，观察效果，直到问题解决为止。对于一些单位来说，配置的浓缩试剂，在经过一段时间后，也要进行阳性强度的评测，以防止配置时间过长后效价的降低，导致阳性强度的减弱。

3.3 试剂的库存管理

实验结束后，需要在“免疫组化试剂登记表”中，对于使用的试剂进行数据的更新，以便及时更换采购试剂。

3.4 实验室的清洁、整理

清洁工作场所内的脏污，必要的东西分门别类以一定的顺序放置，保持工作场所干净、整洁。对于使用过的仪器，做好仪器的日常维护，记录使用情况。另外，实验室的卫生对于实验人员也有一定的安全保护作用。

4 讨论

免疫组化质量的好坏影响的因素方方面面。要确保免疫组化结果的可靠性和稳定性，加强免疫组化室内质量控制管理，制定相应质控标准尤其重要。笔者结合本科室的实际情况，对实验前、实验中和实验后三个层面可能影响免疫组化染色结果的因素进行分析、总结，制定本科室免疫组化室内质控管理相关细则，在日常工作实践中得到检验。我们发现，标本及时用10%中尔马林固定，取材大小适当，组织良好的脱水，切片的厚度适宜并做防脱片处理，选择高压热修复，抗体效价的评估，采用全自动免疫组化仪代替手工操作，并做阳性与阴性对照，依照公认的免疫组化判断标准等因素，是一个相对稳定的免疫组化室内质量控制的条件。各个环节制定相应的质控标准，以达到标准化管理目标。另外每个实验室应当建有本实验室免疫组化检测的SOP文件，所谓的SOP是指 Standard Operation Procedure三个单词中首字母的大写，即标准作业程序，就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。定期做好实验室室内质量控制，真正把SOP文件应用到实际工作中去。每一个实验人员在进行免疫组化操作的时候，也应该有严肃的态度和高度的责任心，才能在制片过程中做到一丝不苟，才能做出优秀的切片。制度化、规范化操作是实现标准化操作的前提条件[14，15]，全自动免疫组化仪器的使用是必要手段，阳性和阴性对照的设立是结果可信的可靠保证，稳定良好的染色质量和可靠的结果判读才是免疫组化质控标准化管理的最终目的。

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免疫组化技术范文第9篇

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年6月～2015年2月我院病理科22例乳腺肿瘤术中的冰冻切片，其中浸润性导管癌7例、导管原位癌3例、导管状瘤3例、状癌2例及其他良性乳腺肿瘤7例。纳入标准为：①阅冰冻HE片后，是否浸润难以确定；②良恶性难以区分。

1.2主要试剂 即用型EnVision super非生物素免疫组化检测试剂盒，鼠抗人CK5/6 单克隆抗体，阳性对照选用迈新公司提供的阳性对照片，阴性对照选用鼠IgG同比稀释液。

1.3方法

1.3.1常规免疫组化检测技术 ①石蜡切片65℃烘箱2h后，常规脱蜡水洗；②高温高压修复，PBS 清洗3min×3次；③除去PBS液，置放在4℃冰箱，滴加一抗后PBS清洗3min×3次，滴加二抗后存放在室温下孵育30min；④除去PBS液，DAB显色，高倍镜下观察；⑤自来水冲洗后进行苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明及中性树胶封固。

1.3.2快速免疫组化检测技术 ①冰冻切片甲醇固定20s后迅速入PBS清洗3次；②滴加一抗37℃孵育10min后再予PBS清洗20s 3次；③二抗37℃孵5min后予PBS清洗20s 3次；④DAB显色，苏木素复染10s，常规脱水封片。

1.4 判断结果 将阳性细胞按其数量及染色强度分为3级，按阳性细胞所占比例及分布情况记录如下：阳性细胞数50%记为强阳性（+++）。

1.5统计学处理 采用SPSS 18.0 统计软件进行数据统计分析，计数资料采用χ2检验，以P

2 结果

22例乳腺肿瘤患者的术中冰冻切片行快速EnVision免疫组化法，结果发现无明显的信号染色干扰背景，两种免疫组化检测技术诊断结果符合率高但清晰度及步骤优于组织切片常规免疫组化染色，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

3 讨论

大部分乳腺肿瘤的腺泡周围有功能性血管纤维结缔组织，乳腺整个腺管系统均被覆有腺上皮和肌细胞两层细胞。腺泡在病变情况下，细胞形态及成分比例的变化，不同病变其免疫组化表型也各有不同，特别是判断肌上皮的存在与否对乳腺疾病的病理诊断和鉴别诊断是非常重要的[3]。但在HE切片上，是很难对此做出判断的。在乳腺腺管的中间腺细胞、定向干细胞和中间肌细胞中表达CK5/6，其中85%～98%普通导管增生CK5/6强阳性，而导管原位癌和不典型导管增生中的表达明显减少，可作为导管原位癌和小叶原位癌，普通导管/小叶增生鉴别的有用标记物[4，5]。快速免疫组化法与常规法相比，步骤相应缩短。此外，因抗原非常新鲜，与一抗二抗结合的时间缩短，也不易发生抗原丢失的现象，对实验结果不会产生影响。本研究发现，快速EnVision免疫组化法检测CK5/6在乳腺肿瘤中的表达结果与常规免疫组化相比，病理诊断结果相符率较高。22例乳腺肿瘤患者的冰冻切片中，除1例导管原位癌的CK5/6的表达EnVision快速法为阴性但常规法为阳性外，其余诊断结果均基本相符。笔者分析可能是由于连续切片后，只选一片组织做检查出现无所测抗原或者是个别组织对抗体的表达差异而造成的。

病理诊断医师在巨检的时候，凭经验认为仅凭阅冰冻HE片可能难以区别良恶性，往往需要借助免疫组化结果来诊断，常规冰冻切片可以和快速免疫组化同步进行，不影响冰冻诊断的出报告时间。在阅冰冻HE片后，需要借助免疫组化结果来诊断的可以进行快速免疫组化法，能起到明确诊断的关键作用。

综上所述，笔者认为应用快速EnVision免疫组化法检测乳腺术中冰冻标本中CK5/6的表达情况，速度快且准确率高，对病理医生诊断所测乳腺标本的病理学类型发挥重要作用，并为临床医生决定手术方法和范围提供有效帮助。

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免疫组化技术范文第10篇

【关键词】 肿瘤；免疫组化法；活检穿刺法；病理诊断

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.11.017

肿瘤是临床常见疾病， 近年来的发病率逐渐增高。无论是良性肿瘤还是恶性肿瘤， 早期临床症状均不典型， 尤其是恶性肿瘤患者往往在中晚期才能确诊， 此时已经错过了最佳治疗时机， 影响了患者的预后[1]。因此， 对于早期肿瘤的诊断是目前临床所关注的一大重点。目前早期肿瘤尚缺乏理想的诊断方案， 常规方案包括CT、超声弹性成像、MRI等影像学检查， 但此类方案的漏诊、误诊率较高[2]。病理诊断作为肿瘤诊断的重要检测标准， 虽然具有准确度高的特点， 但具有一定损伤性， 患者体验较差， 此外， 对于病理诊断中的不同技术应用价值尚存在争议。一般的病理检验多以活检穿刺诊断为主， 该方案虽然能够确定疾病类型及分期， 但患者体验较差[3]。随着医疗技术的进步， 免疫组化技术融入了抗原修复、敏感检测及自动免疫染色系统， 不但提高了诊断准确率， 更改善了检查体验。本文就免疫组化法用于肿瘤患者病理诊断的临床效果进行了研究分析， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 研究对象选取2014年1月～2015年4月本院收治的112例肿瘤患者， 男61例， 女51例， 年龄25～70岁， 平均年龄（43.9±11.4）岁；肺癌22例， 肝癌37例， 转移性肿瘤51例， 血管瘤2例。根据病理诊断方案不同将患者分为观察组和对照组， 各56例。

1. 2 方法

1. 2. 1 对照组采用穿刺活检法进行诊断， 根据影像学显示的病灶部位进行穿刺， 超声下取出组织进行活检， 与标准组织进行对比。

1. 2. 2 观察组采用免疫组化法进行诊断， 主要试剂包括脱水剂、固定剂、蒸馏水、透明液、浸蜡液、树胶等。取患者0.2 cm×1.0 cm×2.0 cm的1块组织置于甲醛溶液中充分浸泡2 h， 置于透明液1 h， 之后用脱水剂脱水1 h， 置于浸蜡液1 h， 埋于石蜡中常规切片， 层厚2 μm， 将组织切片进行免疫组化染色， 在37℃下置于3%过氧化氢溶液中孵育10 min， 蒸馏水冲洗3 min， 高压修复2 min， PBS洗涤5 min， 常温孵育2 h， PBS洗涤5 min， 加入UltrasenSitive SP试剂， 孵育后DBA显色， 树胶封固。

1. 3 观察指标及评定标准 对比两组检测结果， 包括甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3等， 染色呈棕黄色为阳性， 否则为阴性。采用问卷调查形式了解患者的诊断体验， 主要包括心理顾虑、生理问题、信任感3个维度， 每个维度10个条目， 每个条目根据患者回答情况赋分0～10分， 分值越高这说明患者对该检验方案的体验度越好， 总分≥200分为满意。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P

2 结果

2. 1 阳性率对比 观察组染色后细胞结构为变异型， 甲胎蛋白及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3异常表达48例， 阳性率85.7%、满意度82.1%， 对照组的阳性率50.0%、满意度57.1%， 两组对比差异具有统计学意义 （P

2. 2 患者体验对比 诊断体验调查结果显示， 观察组患者的心理顾虑、生理问题、信任感评分均显著高于对照组， 差异具有统计学意义（P

3 讨论

随着医疗技术的进步， 免疫组化技术被越来越广泛的应用于肿瘤患者的诊断， 并取得了理想的效果。免疫组化技术诊断的准确率必须以可靠的免疫组化切片为基础， 因此在诊断中要加强医生和技术人员之间的协调性， 确保免疫组化切片顺利完成， 但由于技术仍不够成熟， 目前免疫组化技术也不能排除假阳性和假阴性的几率[4]。

为了提高诊断准确率， 免疫组化法的使用过程中要遵循以下几点：①固定， 在对组织进行固定时要采用10%的甲醛固定液， 能够更好、更长时间的固定组织， 能够确保目标组织3个月内具有稳定的阳性率[5]；②烤片， 在烤片过程中要注意温度的把握， 通常在65℃左右的恒温箱中进行加热烤片， 但要避免温度过高；③修复， 对目标组织进行抗原修复的时间应该控制在8 min， 然后让切片自然冷却并染色；④染色， 既要对组织进行反复染色， 又要避免染色过深影响观察。而免疫组化法的基本机制依赖于酶促反应， 主要是通过酶联反应来使过氧化物酶形成有颜色的复合物， 但是由于肿瘤类型较多， 不同组织标本也存在抗原含量的差异， 因此显色时间不同[6]， 要充分显色才能便于准确观察。

本次研究结果显示， 观察组染色后细胞结构为变异型， 甲胎蛋白及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3异常表达48例， 阳性率85.7%、满意度82.1%， 显著优于对照组的阳性率50.0%、满意度57.1%（P

综上所述， 免疫组化法应用于肿瘤患者的病理诊断临床应用价值更高， 患者体验度更好， 值得在临床上推广和应用。

参考文献

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