论文实例：小麦特异种质资源分子生物学研究

作者简介：魏育明，男，1971年09月出生，1997年09月师从于四川农业大学郑有良教授，于20__年07月获博士学位。摘要

小麦是世界上的主要粮食作物之一，在农业生产中占有十分重要的地位。与其它农作物一样，由于在育种中大量使用一些相同的亲本，导致栽培小麦基因大量流失，使其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，对其产量和品质的进一步改良起着极大的限制作用。虽然在小麦的野生近缘物种中有许多改良小麦的优异基因，但将这些基因导入到普通小麦需要特定的一些技术和手段，而且效率较低。现有栽培品种和地方品种，特别是一些特异材料，是小麦的初级基因库，其中也含有改良小麦产量和品质所需的一些优异基因。从小麦的初级基因库向栽培小麦中转移基因不需要特定的技术和手段。因此，对现有小麦材料和小麦地方品种的遗传多样性进行深入研究和评价，有助于将其中的优异基因向小麦背景中转移，增加栽培小麦品种的遗传多样性。现代分子标记技术的进一步发展和完善，使得人们能够从分子水平对大量材料进行深入研究，详细揭示其遗传多样性。本研究利用APAGE、SDS-PAGE、荧光原位杂交技术（FISH）、RFLP、R、STS-PCR等常规和分子标记方法，对多小穗小麦新种质‘10-A’背景中的黑麦染色质及其对农艺性状的影响、中国特有小麦地方品种中的贮藏蛋白基因多样性、中国特有小麦地方品种群体间和群体内的遗传多样性及其遗传关系、中国高抗赤霉病小麦地方品种间的遗传多样性等几个方面进行研究，取得的主要研究结果如下：

1.利用APAGE、荧光原位杂交技术（FISH）、PCR和RFLP标记，对导入黑麦多小穗等性状创制的小麦新种质‘10-A’进行了分子检测。APAGE分析发现，‘10-A’与其他T1BL.1RS易位系一样，含有黑麦1RS的醇溶蛋白标记位点Gld1B3。用黑麦1RS的特异性PCR引物对‘10-A’的基因组DNA进行扩增，发现其也具有黑麦的1RS染色体。以黑麦基因组总DNA作探针，用中国春基因组DNA做封阻，与‘10-A’根尖细胞有丝分裂染色体进行荧光原位杂交，结果表明黑麦1R染色体的整个短臂（1RS）易位到‘10-A’中。用25个RFLP标记进行Southern分析，进一步发现10-A的1特异性限制片段发生丢失，代之以黑麦1RS的特异性限制片段，而位于其他染色体上的特异性限制片段未发生缺失。FISH和RFLP标记同时表明，‘10-A’中没有小麦4A-黑麦4R染色体易位。据此认为，多小穗小麦新种质‘10-A’属于T1BL.1RS易位系。同时，本研究还对‘10-A’的多小穗改良系进行了分子检测，发现他们均具有T1BL.1RS易位染色体。

2.对几种鉴定小麦背景中的T1BL.1RS易位染色体的常规方法和分子标记方法进行比较发现，APAGE方法是一种快速有效的方法，最易于在小麦育种选择中应用。

3.以来源于多小穗小麦新种质‘10-A’、普通穗型小麦品系88-1643和川育12号组配的三交组合‘10-A’/88-1643//川育12号的重组系为供试材料，选用4个RFLP标记和1个醇溶蛋白标记Gld1B3分析了T1BL.1RS易位染色体对农艺性状和籽粒蛋白质含量、及其性状间的简单相关和偏相关的影响。结果表明，T1BL.1RS易位[文秘站:]染色体对小麦小穗数、每小穗结实粒数、千粒重、穗粒重、株高和籽粒蛋白质含量等几个性状具有显著的影响，而对穗粒数和抽穗期的影响不大。T1BL.1RS易位系的平均小穗数、千粒重、穗粒重、株高和籽粒蛋白质含量分别比非易位系高5.0、4.6、6.4、5.7和6.8，而平均每小穗结实粒数则低6.9。从农艺性状间的简单相关和偏相关系数来看，一些性状间的显著简单或偏相关关系仅T1BL.1RS易位系群体中检测到，而另一些性状间的显著简单或偏相关关系仅在非易位系群体间检测到。同时，一些性状间的简单相关系数在易位系和非易位系群体间的差异性达到显著或极显著水平。这些结果表明，T1BL.1RS易位染色体不仅对小麦农艺性状和籽粒蛋白质含量具有显著的效应，而且对性状间简单相关和偏相关的程度和性质均有一定的影响。

4.利用APAGE和SDS-PAGE技术对四川白麦子地方品种、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻麦的醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基进行了分析。结果发现，在89份四川白麦子地方品种中，共出现35种醇溶蛋白带型和3种高分子谷蛋白亚基组合，其中2份小麦地方品种的醇溶蛋白带型和87份小麦地方品种的高分子谷蛋白亚基组合与‘中国春’一致。在14份云南铁壳麦中，出现了8种醇溶蛋白带型和3种高分子谷蛋白亚基组合。在9份半野生小麦中，出现了9种醇溶蛋白带型和4种高分子谷蛋白亚基组合。在9份新疆稻麦中，出现9种醇溶蛋白带型和5种高分子谷蛋白亚基，其中1份材料具有Glu-D1编码的新亚基2.1 10.1。从醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基表型来看，新疆稻麦和半野生小麦的醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基变异最高，其次为云南铁壳麦，而四川白麦子小麦地方品种的醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基变异则最低。

5.根据醇溶蛋白APAGE图谱和高分子谷蛋白亚基SDS-PAGE图谱，研究了四川白麦子地方品种、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻麦的Gli-1、Gli-2和Glu-1位点的等位基因变异频率。在89份四川白麦子地方品种、14份云南铁壳麦、9份半野生小麦和9份新疆稻麦的Gli-1位点上，分别发现14、10、14和11个等位基因；在Gli-2位点上，分别发现15、9、13和12个等位基因；而在Glu-D1位点上，则分别出现了5、5、6和8个等位基因。从等位基因出现的频率来看，新疆稻麦和半野生小麦的等位基因变异频率远远高于云南铁壳麦和四川白麦子。从不同基因位点来看，Glu-1位点的等位变异又低于Gli-1和Gli-2位点的等位变异。

6.根据Gli-1、Gli-2和Glu-1位点的等位变异频率计算四种小麦地方品种群体内的Nei’s遗传变异系数。在四川白麦子、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻麦的平均Nei’s遗传变异系数分别为0.3706、0.3798、0.5543和0.5693，表明半野生小麦和新疆稻麦的种子贮藏蛋白基因的遗传多样性高于四川白麦子和云南铁壳麦。从醇溶蛋白位点和高分子谷蛋白位点的遗传多样性来看，这4种小麦地方品种的Gli-1和Gli-2位点的平均遗传变异系数分别为0.5486、0.6632、0.7161和0.6770，而Glu-1位点的平均遗传变异系数则分别为0.0148、0.1777、0.2305和0.3540，远远低于前者，说明醇溶蛋白位点的遗传多样性远远高于高分子谷蛋白位点的遗传多样性。从染色体组来看，位于B染色体组的Gli-B1、Gli-B2和Glu-B1位点的遗传变异系数又高于A、D染色体组相应位点的遗传变异系数，表明B染色体组的遗传变异高于A、D染色体组。

7.利用Glu-Ax、Glu-Bx、Glu-A3、Glu-B3和Glu-1Dx5的特异性PCR引物，和位于1染色体上的γ-醇溶蛋白和低分子谷蛋白2对R标记，通过PCR的方法研究了8份四川白麦子、14份云南铁壳麦、9份半野生小麦和9份新疆稻麦贮藏蛋白基因的遗传多样性。结果表明，Glu-Ax、Glu-Bx、Glu-A3和Glu-B3等4个位点的遗传多样性较低，而γ-醇溶蛋白和低分子谷蛋白2个R位点的遗传多样性较高。所有40份供试材料均未扩增出Glu-1Dx5基因的特异DN段，说明这些小麦地方品种不含5亚基的编码基因。

8.利用14个STS-PCR的28种引物-酶组合和24个R标记对四川白麦子、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻等4种中国特有小麦地方品种群体间和群体内的遗传多样性进行了研究。在供试的40份材料中，11对STS-PCR引物（78.6）的16种引物-酶组合（57.1）能揭示材料间的遗传多样性。在28种STS引物-酶组合中，共获得121条扩增DN段，其中32.7的片段具有多态性。在24个R位点上，21个位点（87.5 ）能够揭示材料间的多态性。在40份材料中，共检测到83个R等位变异，平均每个位点为3.46个等位变异。

9.根据STS-PCR和R标记的多态性，计算了材料间的Nei’s遗传相似系数，并采用UPGMA方法对其进行遗传聚类。结果发现，STS-PCR和R标记揭示的4种特有小麦地方品种群体内的遗传相似性均一致地表明四川白麦子和云南铁壳麦的群体内遗传相似性较高，而半野生小麦和新疆稻麦群体内的遗传相似性较低。这说明新疆稻麦和半野生小麦群体内的遗传多样性较高，而四川白麦子和云南铁壳麦群体内的遗传多样性较低。同时，STS-PCR和R标记均能将所有40份材料相互区分开。从4种小麦地方品种间的遗传关系来看，新疆稻麦与其它3种小麦地方品种间遗传分化较大，单独聚为1类；而四川白麦子和云南铁壳麦间的遗传关系较近，但部分半野生小麦也与云南铁壳麦间具有较近的遗传关系。从R标记和STS-PCR标记揭示的群体间和群体内遗传相似系数的大小来看，与STS-PCR标记相比，R标记在材料间的多态性更高，能够揭示更多的遗传差异。

10.在本研究中，从种子贮藏蛋白来看，‘中国春’与‘成都光头’的醇溶蛋白带型和高分子谷蛋白亚基组合完全一致。从STS-PCR和R标记揭示的遗传关系来看，‘中国春’与‘成都光头’间的遗传相似性最高。这些结果进一步证实‘中国春’是‘成都光头’的一个选系。

11.利用R标记对来源于贵州、云南和四川的8份高抗赤霉病小麦地方品种和4份高感赤霉病小麦材料间的遗传多样性进行了研究。在小麦21条染色体的25个R位点上，共检测到74个等位变异，平均2.96个；其中21个位点（84）能够揭示材料间的多态性。根据R标记揭示的遗传相似性来看，虽然高抗赤霉病小麦地方品种间以及它们与高感材料‘中国春’间的遗传相似性较高、遗传多样性低，但是它们与高感赤霉病的人工合成双二倍体‘R’和意大利小麦品种‘阿勃’间具有相当高的遗传多样性。这些结果表明，可利用高抗赤霉病的小麦地方品种与高感赤霉病的人工合成双二倍体‘R’或意大利小麦品种‘阿勃’之间杂交，构建分子标记遗传分析群体，以标记其中的抗赤霉病基因。

关键词：小麦，黑麦，地方品种，赤霉病，多小穗，农艺性状，蛋白质，遗传多样性，APAGE，SDS-PAGE，FISH，RFLP，STS-PCR，R

TheMolecularBiologyofSomeecialWheatGermplasms

Atract

Wheat(TriticumasetivumL.)isoneofthemostimportantcroinworld.Astheothercrop,thegeneticdiversityofcultivatedwheathasbeengreatlyerodedbythefrequentuseofsameparentalgenotypesforbreedingcultivars.Geneticerosionnotonlylimitsthefurtherimprovementofyieldandqualitybutalsomakeswheatincreasinglyvulnerabletobiologicalandenvironmentalstre.Althoughtherearemanygoodgenesfortheimprovementofwheatintherelatedwildecies,theintroductionofthesegenesfromwildicestocultivatedwheatneedsomeecialcytogeneticmanipulatio.Themoderncultivarsandlandracesaretheprimarygenepoolofcultivatedwheat.Therealsohadmanygoodgenesforwheatimprovementintheprimarygenepool,andnoecialcytogeneticmanipulationwasnecearytotrafergenesfromtheprimarygenepooltocultivatedwheat.Thus,itisanimportantworktoevaluatethegeneticdiversityoftheseresources.Themolecularbiologytechniquesmakeitispoibletoevaluatethegeneticdiversityamongthewheatgermplsmsindetail.Theobjectivesofthisstudyweretodetecttheryechromatininthebackgroundofanewmultiikeletwheatgermplasm10-Aandtheeffectsofthisryechromatinontheperformanceofagronomiccharacters,todescribethegeneticvariatioofseedstorageproteingenesintheChineseendemicwheatlandraces,toevaluatethegeneticdiversityandgeneticrelatiohiamongtheChineseendemicwheatlandraces,andtoinvestigatethegeneticdiversityamongsomeChineselandraceshighlyresistanttoheadscabbyusingAPAGE,SDS-PAGE,FISH,RFLP,STS-PCRandRmarkers.Themainresultsweredescribedasfollowings:

1.UsingAPAGE,FISH,PCRandRFLPmarkers,theryechromatininthebackgroundofanewmultiikeletwheatgermplasm10-Awasdetected.APAGEanalysisindicatedthatthe10-ApoeedthegliadinmarkersGld1B3of1RS.PCRanalysisindicatedthatthe10-Aalsopoeedthe1RSofrye.UsingfluorescencelabeledtotalgenomicDNAofryeasprobesandcommonwheatgenomicDNAofChineseringforblocking,insituhybridizationshowedthatthe1RSofryewastraferredtomultisikeletwheatline10-A.Therestrictionfragmentslocatedontheshortarmofchromosome1Bweremiingandtherestrictionfragmentsof1RSwerepresentwhentheprobes,whichhavebeenidentifiedontheshortarmofthehomologousgroup1,wereusedinRFLPanalysis.FISHandRFLPanalysisindicatedthe10-Adidnotpoethe4A-4Rwheat-ryetralocationchromosome.Theseresultssuggestedthatthemultiikeletwheatline10-AcarriedtheT1BL.1RSwheat-ryetralocationchromosome.Inthisstudy,somerecombinantswithmultiikeletderivedfromatriplecro,10-A/88-1643//Chuanyu12,werealsodetected.AllofthemalsopoetheT1Bl.1RStralocationchromosome.

2.AcomparisonofsomenormalandmolecularmethodsforidentifyingandsurveyingthepresenceofT1BL.1RStralocationinwheatwasconducted.TheresultindicatedthatAPAGEistheeasiestan doftenfasterforscreeningpurposesinwheatbreeding.

3.TheeffectsofT1BL.1RStralocationchromosomeontheperformanceofagronomiccharacters,thegrainproteincontent,andthesimpleandpartialcorrelationcoefficientsamongcharacterswereinvestigatedwith4RFLPmarkersand1gliadinlocusGld1B3inrecombinantsderivedfromatriplecro,10-A/88-1643//Chanyu12.TheT1BL.1RStralocationchromosomehadsignificenteffectsonikeletnumberperike,graiperikelet,1000-grainweight,graiweightperike,plantheightandgrainproteincontent,whilenosignificenteffectsongraiperikeandheadingdatewasdetected.TheT1BL.1RStralocationlinesresultedin5.0,4.6,6.4,5.7and6.8increaseinikeletnumber,1000-grainweight,graiweightperike,plantheightandgrainproteincontentthanthenon-T1BL.1RStralocationlines,reectively.AndtheT1BL.1RStralocationlinesresultedina6.9decreaseingraiperikeletthan1Bgenotypes.SomesignificentsimpleandpartialcorrelationcoefficientswereonlydetectedwithintheT1BL.1RStralocationgrou,whilesomesignificentrelatiohiwereonlydetectedwithinthenon-T1BL.1RStralocationgrou.AndthesignificantdifferencesofsomesimplecoefficientsweredetectedbetweentheT1BL.1RSand1Bclaes.TheseresultssuggestedthattheT1BL.1RStralocationchromosomenotonlyhadeffectsontheperformanceofagronomiccharactersandgrainproteincontentbutalsohadimpactonthesimpleandpartialcorrelationcoefficientsamongcharacters.

4.UsingAPAGEandSDS-PAGEmethods,thegliadinandHMW-gluteninsubunitsvariatiowereevaluatedinSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheat.In89landracesofSichuanWhiteWheat,atotalof35gliadinpatterand3HMW-gluteninsubunitscombinatiowerefounded.Intheselandraces,2landraceshadidenticalgliadinpartternwith’Chinesering’,and87outof89landraceshadthesameHMW-gluteninsubunitscombinationwith’Chinesering’.In14acceioofYuanHulledWheat,8gliadinpatterand3HMW-gluteninsubunitscombinatiowereaeared.In9acceioofTibetanWeedrace,eachacceionhaduniquegliadinpattern,and4HMW-gluteninsubunitscombinatiowerefoundedintheseacceio.Atotalof9gliadinpatterand5HMW-gluteninsubunitscombinatioweredetectedin9XinjiangRiceWheat.TheseresultsindicatedthatmoregliadinandHMW-gluteninvariatiopresentedinTibatanWeedraceandXinjiangRiceWheatthanSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat.

5.TheallelicvariatioatGli-1,Gli-2andGlu-1lociin89SichuanWhiteWheatlandraces,14YuanHulledWheatacceio,9TibetanWeedraceand9XinjiangRiceWheatacceiowerestudiedbasedontheAPAGEandSDS-PAGEpatter.Therewere14,10,14and11allelesatGli-1inSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheat,reectively.Intotal,15,9,13and12alleleswereidentifiedatGli-2inabovegrou,reectively.Only5,5,6and8alleleswerecharacterizedatGlu-1inabovegrou,reectively.Fromthefrequencyofaparticularalleleateachlocus,itindicatedthatmoreallelicvariatiopresentedinTibatanWeedraceandXinjiangRiceWheatthanSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat.AndtheallelicvariatioatGlu-1werelowerthanGli-1andGli-2.

6.BasedontheallelicvariatioatGli-1,Gli-2andGlu-1loci,thegeneticdiversityateachlociwasinvestigatedinSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheat.TheNei’sgeneticvariationindexes(H)amongabove4grouwere0.3706,0.3798,0.5543and0.5693,reectively.ItindicatedthatthegeneticdiversityofstorageproteingenesamongTibatanWeedraceandXinjiangRiceWheatwerehigherthanthatofSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat.AtGli(Gli-1andGli-2)loci,theNei’sgeneticvariationindexes(H)amongabovegrouwere0.5486,0.6632,0.7161and0.6770,reectively.ButatGlu-1loci,theNei’sgeneticvariationindexes(H)were0.0148,0.1777,0.2305and0.3540,reectively.AndtheNei’sgeneticvariationindexes(H)atGli-B1,Gli-B2andGlu-B1locilocatedonB-genomewerehigherthanthoseofrelativelocionA-and D-genomes.TheseresultssuggestedthatthegeneticdiversityatGliwashigherthanthatofGlu-1,andthegeneticdiversityofstorageproteingenesonB-genomewashigherthanthatofA-andD-genomes.

7.FiveecialPCRprimersforGlu-Ax,Glu-Bx,Glu-A3,Glu-B3andGlu-1Dx5,and2Rprimersforγ-gliadinandLMW-gluteninwereusedtoinvestigatedthestorageproteingenevariatioamong8SichuanWhiteWheatlandraces,14YuanHulledWheatacceio,9TibetanWeedraceand9XinjiangRiceWheatacceio.ThePCRanalysisindicatedthatlowlevelgeneticdiversitywerefoundatGlu-Ax,Glu-Bx,Glu-A3andGlu-B3,whilehighlevelgeneticdiversitywerefoundedattheRlociofγ-gliadinandLMW-glutenin.TheecialDNAfragmentofGlu-1Dx5wasnotdetectedamongall40acceio.Itindicatedthattheredidnothavesubunit5encodedbyGlu-D1intheseacceio.

8.Using28primerset-enzymecombinatioof14STS-PCRmarkersand24Rmarkers,thegeneticvariatioamongSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheatwereinvestigated.Elevenoutof14STS-PCRprimersets(78.6)and16outof28primerset-enzymecombinatio(57.1)werepolymorphic,producingatotalof121fragmentswithanaverageof4.3fragmentsperprimerset-enzymecombinatio.At24Rloci,21Rloci(87.5)werepolymorphic,detectingatotalof83alleleswithanaverageof3.5allelesperRloci.

9.TheNei’sgeneticsimilarity(GS)indexeswithinandbetweengrouwerecalculatedbasedontheSTS-PCRandRdata.TheGSamongthegrouofSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat,revealedbySTS-PCRandRmarkers,werehigherthanthatofTibetanWeedraceandXinjiangRiceWheat.ItsuggestedthatthegeneticdiversityamongTibetanWeedraceandXinjiangRiceWheatwerehigherthanthatofSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat.RmarkerscanrevealmoregeneticvariatiowithinandbetweengrouthanSTS-PCRmarkers.ThegeneticrelatiohiwithinandbetweengrouwereestimatedbyaUPGMAclusteranalysisofGSmatrix.Theresultsshowedthatall40landracescouldbedistinguishedbySTS-PCRmarkersorRmarkers.TwodistinctclustersareevidentfromthematrixbasedonSTS-PCRandRdata.Thefirstcoistsofall9XinjiangRiceWheatacceio.ThesecondclustercoistsofallacceiofromSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheatandTibetanWeedrace.TheseresultssuggestedthattheXinjiangRiceWheatgroupwasgeneticallydistinctfromotherthreeChineselandracegrou,whileSichuanWhiteWheatgroupwasgeneticallyrelatedtoYuanHulledWheat.IntheTibetanweedracegroupismorediversethanSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat,withsomeacceiomorerelatedtoYuanHulledWheat.

10.Inthisstudy,’Chinesering’hadidenticalgliadinandHMW-glutninpatterwith’Chengdu-guangtou’.Andthegeneticsimilarityof’Chinesering’with’Chengdu-guangtou’,revealedbySTS-PCRandRdata,washigherthanthatof’Chinesering’withotherlandrace.Thesewerefurthersuortstotheproposalthat’Chinesering’isastrainof’Chengdu-guangtou’.

11.Thegeneticdiversityamong8wheatlandraceshighlyresistanttoheadscabnativetoGuizhou,YuanandSichuan,and4wheatlineshighlysusceptibletoheadscabwereevaluatedbyRmarkers.The25Rmarkers,usedinthisstudy,werelocatedon23chromosomearms,representingall21chromosomesofwheatgenomes,andrevealedatotalof74alleleswithmeanof2.96allelesperRmarker.Twenty-oneof25Rmarkers(84)werepolymorphicamong12genotypes.Thegeneticsimilarityamonghighlyresistancelandraces,andtheselandraceswithhighlysusceptiblewheatcultivar’Chinesering’wereveryhigh,butthegeneticdiversityoftheselandraceswith2highlysusceptiblelines,syntheticwheat’R’andItalianwheatcultivar’Aandanza’,weremuchhigher.Theseresultssuggestedthatitispoibletotagthegenesresistanttowheatscabinthesehighlyresistantwheatlandracesbychoosingsyntheticwheat’R’orItalianwheatcultivar’Aandanza’asanotherparentforgenemaing.