热休克蛋白90促进糖尿病创面愈合的作用研究

[摘要]目的:研究HSP90在糖尿病性难愈创面中的作用。方法:在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠背部做d=2cm的全层皮肤缺损模型,并随机分为四组:空白组(B组)、HSP90组(C组)、胰岛素组(D组)及HSP90与胰岛素联合用药组(E组)。另设一组正常大鼠同样在背部做d=2cm全层皮肤缺损模型作为对照组(A组),每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗。于创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,各时间点标本采用免疫组化ABC法观察HSP90,并计算其平均密度值及积分光密度值,观察其表达规律。结果:大体观察下,在计算第21天的创面愈合率后我们发现, C组(85.9%)、D组(86.8%)及E组(96.8%)相较于B组(79.7%)创面愈合率均有显著提高(P

[关键词]热休克蛋白90(HSP90);糖尿病;难愈创面;创面愈合

[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)05-0691-04

Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats

REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P

Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes

糖尿病造成的难愈创面已成为目前临床治疗的一大难题,研究表明,高糖会抑制人表皮细胞的迁移,从而导致创面上皮化延迟[1-2]。近来,Li.W的研究发现热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能够有效促进人表皮细胞的迁移[3],而关于其是否能够有效促进糖尿病性难愈创面的研究并未见报道。本实验旨在将HSP90应用于糖尿病性难愈创面,并辅以胰岛素作为参照,以观察不同时期各组创面的愈合程度及创面中HSP90的表达含量。

1材料和方法

1.1动物及分组:选用健康清洁级雄性SD大鼠100只,由第四军医大学动物试验中心提供,体重(200±3)g,分为A、B、C、D、E五组,每组20只。A组为正常创面但不予以任何治疗,即对照组;B组为糖尿病大鼠难愈创面给予空白凡士林药膏治疗组,即空白组;C组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90的凡士林药膏治疗组,即HSP90组(HSP90浓度:1μg/ml);D组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有胰岛素的凡士林药膏治疗组(胰岛素浓度:30μg/ml)E组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90及胰岛素的凡士林药膏治疗组,即联合用药组(E组,HSP90浓度:1μg/ml,胰岛素浓度:30μg/ml)。每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,

1.1.1 构建2型糖尿病难愈创面模型:采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法诱导2型糖尿病造模。各组提前4周高脂高糖饮食,饥饿12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并维持高脂高糖饮食,并于注射后48h用强生稳步血糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,体重明显下降(>50g)为造模成功[4]。三天后补注STZ(以10～20mg/kg体重剂量腹腔注射),并测量FBG值。切取全层皮肤暴露肉膜为准后以d=2cm的金属环间断缝合固定于创缘,防止创面挛缩。

1.1.2 给药及分组:A组不涂抹任何药物;B组为空白药膏;C组为含有浓度1μg/ml HSP90的药膏;D组为含有浓度30μg/ml胰岛素的药膏;E组为含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰岛素的药膏。各给药组均以外用涂抹局部给药,药膏均匀覆盖整个创面(约1g/次)为准(含有药物的药膏均委托金花生物制药集团有限公司完成)。HSP90的浓度为我们参考了Li.W试验中用于正常创面的治疗浓度后[3],并以15只糖尿病大鼠给予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml进行了简单的预实验,发现三种浓度的效果并无显著差异,所以取最小浓度。

6941,

2实验过程及观察设计

在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗,动物创面予以暴露。创面的固定环会于创面形成后的第10天予以摘除,因为此时皮肤挛缩力量较大,会导致缝合线断裂,为统一标准予以摘除。并创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5个时间点各取n1=3个标本,而在第21天取n2=5个标本,各标本取材时取全层厚皮肤,保留创缘约1～2mm的正常皮肤。

2.1 大体观察指标:分别于用药后第3、5、7、10、14、21 进行大体拍照观察并采用ADOBE photoshop cs4 计算各时期的创面愈合率;

2.2 镜下观察指标:并于3、5、7、10、14、21天取创面标本,3、5、7、10、14天每组各时间点3只,21天时每组5只。皮肤标本剪成横断面,标本均用1%中尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,分别进行HE染色、并使用ABC法进行HSP90的免疫组化染色。并采用image pro plus 6.0彩色图像分析系统, 每张切片选取5个有代表性的200倍视野,测量每个标本HSP90阳性表达密度及积分光密度IOD值的均值并记录。

2.3 数据统计:所得试验数据均采用SPSS11。文中数据以均数和标准差(x±s) 表示,并且对创面愈合率采用两个独立样本t检验进行比较。

3实验结果

3.1 大鼠创面愈合率差异比较:各组大鼠在各时间点创面愈合率比较见表1。由表可见,单独使用HSP90(C组)及单独使用胰岛素(D组)均能够提高创面的愈合率(与同期B组相比,P

3.2 各组创面第10天时HSP90的免疫组化对比:见图1～5。由图可见,联合用药组及正常创面对照组创面中,HSP90的阳性表达较为强烈。

3.3 HSP90阳性表达的比较:为更加客观的反应HSP90在创面中的阳性表达状况我们选取平均阳性率及积分光密度作为指标[5-6]。各组大鼠各时间点HSP90平均阳性率(Density Mean,DM)值的比较见图6。各组大鼠各时间点创面中HSP90的平均积分光密度(Identical Optical density,IOD)的比较见图7。

由图6、图7我们发现:①在糖尿病大鼠创面中,HSP90的表达明显下调(同期对照组相比,P

4讨论

美国创面愈合协会的资料显示大约有66%的难愈性创面即使经过6个月的治疗护理仍无法治愈[7],仅处理创面的材料每年就花费90亿美元[8]。糖尿病创面的治疗一直是难题,表皮细胞迁移迟缓也是其发生机制的一个重要特点。 在糖尿病创面的临床治疗中,胰岛素的局部应用的疗效及作用机制均得到了验证,这一方法也成为了临床治疗糖尿病创面的经典方法。而其作用机制主要在于降低创面组织血糖浓度,加快糖尿病创面的新生毛细血管形成,促进上皮细胞的增殖与迁移[9-10]。

2007年DR. Woodley等发现人表皮细胞受到缺氧刺激后,会大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能够有效促进人表皮细胞的迁移,并将其应用于正常创面,发现HSP90α能够加速创面的再上皮化过程[3,11]。在此之前,人们对于HSP90的关注了解更多的集中在癌症领域,作为重要的分子伴侣,它介导了多条调控细胞增殖、凋亡、迁移的信号通路[12],并保护细胞产生应激反应,抵抗各类损伤带给机体的不可逆性伤害[13]

在本实验中我们主要为了研究HSP90是否能够促进糖尿病性难愈创面的愈合,并观察HSP90在糖尿病性难愈创面中的表达,探索HSP90在创面中的表达是否与创面的愈合速率有关联。我们的研究发现:在大体观察下,①外源性给予糖尿病性难愈创面HSP90,同期的创面愈合率有所提高(与同期空白组相比,P0.05)。仅从大体实验的观察结果我们认为,创面中HSP90的表达与糖尿病难愈创面的愈合是存在相关性的。在镜下观察,我们发现:①糖尿病性难愈创面的高糖微环境明显抑制了HSP90的表达(空白组与同期对照组相比,P

分析结果我们认为,高糖环境会降低HSP90在创面中的表达,减弱HSP90对细胞的保护作用。并且创面中HSP90的表达高低与创面的愈合速率具有相关性。虽然无论是局部给予胰岛素改善高糖微环境,还是局部应用HSP90提高创面中HSP90的表达,均能够提高糖尿病性难愈创面的愈合率,但是我们发现联合应用后糖尿病性难愈创面的愈合效果最好。据此我们认为,胰岛素改善了糖尿病性难愈创面的局部微环境,有利于创面中HSP90的表达提高,进一步局部给予HSP90,提高创面中HSP90的含量,从而激活部分HSP90参与调控的信号通路,提高创面中各类生长因子的表达,促进了糖尿病性难愈创面的愈合。

然而,我们的研究尚属浅显,对于HSP90在糖尿病创面愈合过程中的作用机制也未进行研究。但是,依然为我们寻找糖尿病创面的治疗方向提供了一个具有临床应用意义的思路。下一步,我们会对HSP90在糖尿病性难愈创面的作用机制进行进一步的研究,探索HSP90在糖尿病性难愈创面中所调控的与创面愈合密切相关的生长因子与细胞外基质的变化。并且HSP90的提取目前还很昂贵,所以进一步寻找到其稳定的上游信号分子或寻找一种能够有效且廉价的提取HSP90的方法会成为我们今后的研究方向。

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[收稿日期]2010-02-26 [修回日期]2010-04-20

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