不同品牌卷烟主流烟气亚硝胺、氢氰酸释放量与卷烟有害生物效应关系

摘要为探究主流烟气中TSNA、HCN的释放量对人体健康的影响，采用离体细胞培养的方法来检测烟气浓缩物的细胞毒性、动式被动吸烟小鼠急性毒性试验来检测烟气的急性毒性，为卷烟的安全性评价提供毒理学依据.结果表明卷烟烟气冷凝物（CSC）中TSNA、HCN的含量与其生物加权综合毒性大小并没有明显的线性关系.

关键词卷烟烟气冷凝物；TSNA；HCN；生物加权综合毒性

中图分类号TS411文献标识码A文章编号1000-2537（2013）02-0085-05

烟草作为一种特殊商品，满足了消费者生理和心理方面的需要，但流行病学调查结果显示吸烟对人体健康有一定影响.随着研究的深入，医学界对吸烟与健康的影响也产生了迷惑与分歧，吸烟对健康的危害变得模棱两可[1].众所周知，吸烟对人体健康的影响最终是体现在生物体上[2]，建立生物指标来检测和评价卷烟对生物体的效应，对低危害卷烟产品的前期开发和卷烟安全性评价是很有意义的.作者采用离体细胞培养的方法来检测烟气浓缩物的细胞毒性、动式被动吸烟小鼠急性毒性试验来检测烟气的急性毒性，共测定国内外20个不同品牌的卷烟[3]，试验采用2个生物学指标：细胞死亡率和小鼠半数死亡时间，将该数据制成加权数值表，来初步评价卷烟烟气的有害生物效应和烟气中的亚硝胺、氢氰酸含量的相关性.

1材料与方法

1.1实验材料

实验所用烟采用在市面上随机抽样提供，每支烟质量为0.90～0.92 g.

1.2主要试剂

1.3主要实验仪器

JJD100 型单通道吸烟机（郑州烟草研究所），MOODEL 2300 CO2孵箱（Sheldon制造有限公司），月坛牌洁净工作台（北京冠鹏净化设备有限公司），TDL-5T台式离心机（重庆光学仪器厂），LXJ-64-01型离心机（北京医疗仪器修理厂），KUBOTA 6930型低温离心机（久保田商事株式会社），Thermo Forma低温冰箱（Thermo Electron 公司），MCC/340 P酶标仪（Multiakan公司）， HH-SY21-Ni4C型电热恒温水浴锅（北经长风仪器仪表公司）， SARTORIUS BS210S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），API3000液相色谱串联四极杆质谱仪（AB SCIEX公司）.AAⅢ型连速流动分析仪（德国BRAN&RU BBE公司）.

1.4细胞培养

永生化人支气管上皮细胞系BEP2D，以LHC-8无血清培养液（LHC-8 SERUM-FREE MEDIUM with GLUTAMINE）培养，接种于25 cm2或75 cm2的培养瓶内，以95%相对湿度、体积分数为5%（下同）的CO2、37 ℃在培养箱内孵育；细胞每周传代1次，传代后2天换1次液.

1.5卷烟烟气凝集物（CSC）制备

JJD100 型单通道吸烟机设定为1 口/min，分别经过5 mL 有机相（95%的乙醇） 和5 mL 无机相（LHC-12 培养液）收集20 支卷烟的烟气，分装后于-80 ℃贮存备用.

1.6MTT 法检测

把培育的细胞用微孔滤膜过滤除菌后，以LHC-8培养液稀释至所需浓度进行染毒.收集处于指数生长的BEP-2D细胞，按109个/L接种96孔培养板中，其中1排孔作为阴性对照，不作任何处理；另1排孔作为空白对照，分别进行试验烟和对照烟的细胞染毒，每种卷烟设计10个染毒剂量.用25 g/L胰蛋白酶消化BEP2D细胞，并且准确计数.然后用LHC-8培养液稀释单个细胞悬液，以每孔8 000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL；将培养板移入CO2孵箱中，在37 ℃、5%CO2和95%相对湿度条件下，培养24 h；然后以不同浓度CSC 对细胞染毒，每个剂量设4个平行样，终体积仍保持200 μL， 染毒培养72 h后，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，使结晶物充分溶解.选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值，记录结果[4].

1.7TSNA含量检测

将收集了主流烟气粒相物的滤片置于小玻璃瓶中，加入100 μL 5 mg/L的内标混合溶液和10 mL的01 mol/L乙酸铵水溶液，封好玻璃瓶，置于回旋震荡器上以180 r/min转速振荡萃取30 min；分别用1 mL 的甲醇和水先后润洗固相萃取小柱，移取1.0 mL萃取液，用120 μL的1.0 mol/L的氢氧化钠溶液将萃取液调为碱性，碱性液上OASIS MCX （30 mg）固相萃取柱，用1 mL水淋洗，然后用1.0 mL 50%甲醇（体积分数）的水溶液将分析物洗脱，洗脱液装入液相进样小瓶，以备LC/MS/MS分析[5].

1.8HCN含量检测

按YC/T 29-1996标准抽取5支卷烟后，将收集了主流烟气粒相物的滤片置于小玻璃瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L NaOH溶液常温下震荡30 min，用装有过滤头5 mL一次性针筒抽取滤液，装入样品瓶内进行连速流动分析；用装有30 mL 0.1 mol/L NaOH溶液的吸收瓶扑集5支卷烟主流烟气气相中的HCN，吸毕，用01 mol/L NaOH溶液淋洗吸收瓶与主流烟气接触的部分，合并扑集液与淋洗液，用0.1 mol/L NaOH溶液定容至50 mL，取约2 mL装入样品瓶中进行连速流动分析；根据吸光度和工作曲线计算扑集液中的HCN浓度，卷烟烟气中的HCN释放量为粒相（滤片）与气相（吸收瓶）中HCN测定量之和[6].

1.9统计学方法

采用SPSS13.0软件包进行统计学分析.计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义时再用最小显著差（LSD）法进行两两比较，死亡率的比较采用x2检验；以P

2结果与讨论

2.1小鼠急性毒性暴露卷烟烟气的半数死亡时间按急毒大小排序

将雌雄小鼠共20只，采用SPSS13.0程序单因素计算半致死时间（T12）以及95%置信区间（CI），组间动物死亡两两比较采用LSD法，进行Paired-Sample T Test 分析[7-8]，发现不同品牌档次卷烟烟气的半数死亡时间存在明显的差异（表1），这种差异原因可能是各种卷烟组分不同.它们对烟气的急性毒性贡献值有待进一步探究.

3小结

本实验通过对卷烟烟气冷凝物（CSC）中具有代表性的TSNA、HCN的有害成分细胞毒性进行分析，发现TSNA、HCN与 CSC都具有体外细胞毒性，但是不同品牌的卷烟烟气的有害生物学效应存在一定差异，在进行卷烟安全性评价时，生物加权综合毒性大小与亚硝胺、氢氰酸含量没有明显的线性关系.造成这种现象的原因可能为： CSC是一种混合物，各种有害组分之间可能存在一种叠加或协同作用，卷烟的有害生物效应与单个化合物组分的含量关系并不很密切.因此烟草行业和社会公众需要科学、全面、客观地评价卷烟烟气危害性，烟草行业也要致力于降低烟气中的有害成分.

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