DOC2抑制对宫颈癌SiHa细胞系的生长

时间:2022-10-27 10:53:17

DOC2抑制对宫颈癌SiHa细胞系的生长

作者:李萍,辛晓燕,刘淑娟,宋庆贺,毛敬

【关键词】 宫颈癌

Inhibitory effect of DOC2 gene on growth of human cervical cancer SiHa cells

【Abstract】 AIM: To explore the inhibitory effect of DOC2 gene on the growth of human cervical cancer cell line SiHa. METHODS: Recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1p93 (containing exogenous human DOC2cDNA) and vector pcDNA3.1 (with neomycin resistance gene only) were transfected into human cervical cancer SiHa cells (no DOC2 gene expression) with lipofectamine respectively. The growth rate, cell cycle and colony formation rate of transfected cells were observed by MTT assay and FCM assay respectively. RESULTS: The growth of SiHa transfected with DOC2 gene was markedly suppressed (P<0.05). Colony formation rate in soft agar was also decreased significantly (P<0.05). Cell cycle analysis showed that the percentage of cells in G1 phase of SiHap93 cells was significiantly increased while that of cells in S phase was decreased. The percentage of cells in the different phases of the cycle did not significantly vary between the SiHa and SiHapcDNA3.1. CONCLUSION: DOC2 gene can inhibit the proliferation and DNA synthesis of human cervical cancer.

【Keywords】 cervix neoplasms; DOC2; gene therapy

【摘要】 目的: 探讨卵巢癌缺失2(DOC2)基因对宫颈癌SiHa细胞系生长的抑制作用. 方法: 采用基因转染技术,将含有全长DOC2cDNA的真核重组表达质粒和空载体质粒(pcDNA3.1)转染到人宫颈癌SiHa细胞系(无DOC2基因的表达)中,了解其对细胞增殖能力及细胞周期的影响. 结果: 转染DOC2基因的宫颈癌细胞生长受到抑制(P<0.05),其在软琼脂克隆形成能力明显降低(P<0.05). DOC2有使G1期细胞比例增高、S期细胞比例下降的趋势,但SiHa细胞和SiHapcDNA3.1细胞之间无显著差异. 结论: DOC2基因能抑制宫颈癌细胞系的增殖.

【关键词】 宫颈肿瘤;DOC2;基因疗法

0引言

卵巢癌缺失2(differentially expressed in ovarian cancer 2, DOC2)基因能抑制多种肿瘤细胞系的生长,是一个新的候选的肿瘤抑制基因. 为探讨DOC2基因对人宫颈癌细胞的抑制作用,我们采用基因转染技术研究其对宫颈癌细胞增殖的影响,为宫颈癌的治疗提供思路.

1材料和方法

1.1材料无DOC2基因表达的人源性宫颈癌细胞系SiHa由西京医院妇产科实验室提供,常规方法复苏细胞并在37℃, 50 mL/L CO2标准条件下培养. 真核表达载体质粒pCDNA3.1p93(含有人DOC2cDNA)、空载体质粒pCDNA3.1和免疫组化试剂DOC2抗体均由刘淑娟博士惠赠[1-2]. DMEM,质粒转染试剂盒(Lipofectamine 2000)及胰蛋白酶购自GIBCO公司;胎牛血清购自杭州四季青;MTT购自华美生物工程公司; SABC试剂盒与DAB显色剂均购自武汉博士德生物技术有限公司,G418购自Sigma公司.

1.2方法取pCDNA3.1p93 2.5 μL (2.0 μg)与无血清DMEM 250 μL混匀得A 液,另取Lipofectamin2000 5 μL和无血清DMEM 250 μL混匀得B液. A与B两液混匀,室温放置20 min形成脂质体pCDNA3.1p93复合物(C1液);同法制备脂质pCDNA3.1复合物(C2液). 用C1液和C2液分别转染SiHa细胞,同时设未转染的SiHa作对照. 转染48 h后,向培养基中加入G418进行筛选,瓶中G418终浓度由100 mg/L 逐渐升至400 mg/L,每3 d提高1次浓度,筛选抗G418克隆,挑选阳性克隆并扩大培养. 转染克隆采用ABC免疫酶染色法检测DOC2蛋白的表达. 取处于对数生长期的SiHap93细胞,常规胰酶消化并制备SiHap93单细胞悬液,以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板,每孔加1 mL培养基,于接种后24 h开始加入MTT,每次6个复孔,每孔加入75 μL MTT (20 g/L), 37℃, 50 mL/L CO2孵箱孵育4 h后弃去上清,每孔加入0.5 mL DMSO,振荡15 min,再孵育1 h,使结合的MTT充分溶解,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔A值,每日测量1次,连续7 d,并绘制A值时间曲线. 测量期间每2~3 d换液1次. 同法绘制SiHa和SiHapcDNA3.1细胞的A值时间曲线,作为对照. 用去离子水配制7 g/L和12 g/L琼脂溶液,高温高压灭菌后,于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液,高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g/L琼脂溶液等体积混匀后,按1 mL/孔加入24孔培养板,4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g/L琼脂溶液等体积混匀,之后加入SiHap93单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106/L,此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板,铺平后室温放置使琼脂凝固,之后置于37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养2 wk,观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设SiHa和SiHapcDNA3.1对照. 克隆形成率(%)=克隆数÷接种细胞数×100. 取SiHa,SiHapcDNA3.1和SiHap93细胞分别接种于培养瓶,培养至80%~90%融合状态时,用250 g/L胰酶消化并收集细胞;PBS洗涤2次后900 mL/L乙醇固定过夜. 次日再次以 PBS洗涤,并调整细胞浓度1×108~1×109/L,碘化丙锭染色30 min后,应用FCM检测,计算出各期细胞百分比,每组重复3次.

统计学处理: 用SPSS13.0统计软件进行统计分析,组间比较采用完全随机设计的方差分析,两两比较采用LSD法, P<0.05表示具有统计学差异.

2结果

SiHap93细胞p93表达蛋白阳性产物呈棕褐色定位于细胞质. 说明转染后,DOC2基因在SiHa细胞中能稳定表达(图1,2). 比较3种细胞的生长曲线, 可以看出SiHa和SiHapcDNA3.1细胞的生长曲线较为接近, 而SiHap93细胞的生长在3 d后开始明显偏低于前两者(P<0.05). 说明SiHap93细胞在转染DOC2基因后其增殖受到抑制(图3). SiHa, SiHapcDNA3.1和SiHapcDNA3.1三组细胞,每组测量8次,求得其均数±标准差分别为(43.2±5.2)%, (40.9±2.4)%, (17.0±3.7)%,经分析结果为SiHa和SiHapcDNA3.1细胞均有较高的克隆形成率,且两者之间无显著差异;在转染p93后,SiHap93细胞的克隆形成率明显降低,与SiHa和SiHapcDNA3.1之间差异性显著(P<0.05),说明DOC2对细胞的增殖力有 明显的抑制作用. 另经DOC2转染后受阻于G1期的细胞增多,同时S期的细胞相应减少,而与SiHa和SiHapcDNA3.1之间差异显著(P<0.05,表1).

图1阴性SiHa细胞p93蛋白表达SABC ×400(略)

图2转染后阳性产物定于细胞质SABC ×400(略)

图33种细胞的生长曲线(MTT法)(略)

表1DOC2基因对人宫颈癌细胞周期的影响(略)

aP<0.05 vs SiHa和SiHapcDNA3.1.

3讨论

细胞的癌基因和抑癌基因是维持细胞正常生命活动中最重要的一些基因,当它们的基因结构发生改变和异常表达(抑癌基因不表达)时,正常增殖调控紊乱,细胞无限生长,发生癌变. DOC2/DAB2广泛存在于正常组织中,但在许多肿瘤组织和细胞系中低表达或无表达,提示其表达缺失是肿瘤发生的早期步骤[3-4]. 我们将含DOC2cDNA的pCDNA3.1p93真核重组表达质粒和空载体质粒(pcDNA3.1)在Lipofectamin介导下, 转入人宫颈癌SiHa细胞系中,经G418筛选14 d空白对照组细胞全部死亡,而转染空载体和pCDNA3.1p93的细胞仍有存活,并形成克隆,说明这些克隆具有G418抗性,即为转染成功的细胞. 经MTT比色法检测细胞的增殖情况, 发现经p93转染后的宫颈癌细胞,其增殖受到抑制. 此外,SiHap93的克隆形成率明显低于SiHapcDNA3.1和SiHa(P<0.01),也说明经DOC2转染的宫颈癌细胞在软琼脂中克隆形成能力下降,其增殖能力受到明显抑制. 流式细胞仪的分析结果也提示DOC2有使G1期细胞比例增高、S期细胞比例下降的趋势. G1期是细胞的DNA合成前期,增殖旺盛的细胞G1期时间短. 转染DOC2后G1期细胞比例增高、S期细胞比例下降,说明卵巢癌细胞的分裂受到了抑制. 本实验将DOC2/DBA2基因转入人宫颈癌细胞中并获得了稳定的表达,明显抑制了肿瘤细胞的生长及恶性增殖能力,为宫颈癌的基因治疗提供实验依据.

【参考文献】

[1] 刘淑娟,辛晓燕,韩军涛,等. 兔抗人DOC2抗血清的制备与鉴定[J]. 免疫学杂志, 2004,20(6):465-467.

[2] Yano M, Toyooka S, Tsukuda K, et al. Aberrant promoter methylation of human DAB2 interactive protein (hDAB2IP) gene in lung cancers [J]. Int J Cancer, 2005,113(1):59-66.

[3] Dote H, Toyooka S, Tsukuda K, et al. Aberrant promoter methylation in human DAB2 inter active protein (hDAB2IP) gene in breast cancer [J]. Clin Cancer Res,2004 ,10(6):2082-2089.

[4] Kleeff J, Huang Y, Mok SC, et al. Downregulation of DOC2 in colorectal cancer points to its role as a tumor suppressor in this malignancy [J]. Dis Colon Rectum, 2002,45(9):1242-1248.

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