外源蔗糖对盐胁迫条件下甘草幼苗生长及有效成分含量的影响

[摘要]以甘草幼苗为实验材料，研究了外源蔗糖对NaCl胁迫条件下甘草幼苗生长及有效成分含量的影响。结果表明，在盐胁迫条件下，添加一定浓度的外源蔗糖后，甘草幼苗的日相对生长率呈升高趋势，可明显的消弱这种胁迫效应，说明外源蔗糖具有缓解盐胁迫的效应。总黄酮含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性呈极显著升高，外源蔗糖对盐胁迫下甘草幼苗根系生长的缓解作用在很大程度上与PAL活性的增强所引起的黄酮含量的增加有关，当外源蔗糖的浓度为10mmol・L-1时，PAL的活性达到最大，当外源蔗糖的浓度为15mmol・L-1时，PAL的活性又成下降趋势，表明这种缓解作用具有浓度效应。在施加不同浓度的外源蔗糖后甘草苷含量的变化跟总黄酮含量的变化相似，施加不同浓度的外源蔗糖后甘草酸含量比在盐胁迫下高，达到未受盐胁迫时的水平，外源蔗糖的浓度梯度对甘草酸积累的影响不明显。

[关键词]外源蔗糖；盐胁迫；甘草；有效成分

甘草Glycyrrhizauralensis为豆科多年生草本植物，以根和根茎入药，具有补脾益气、清热解毒、调和诸药等功效[1]。其活性成分甘草酸（glycyrrhizinicacid）集累于根部，是甘草中最重要的有效成分之一，具有抗炎、抗病毒和保肝等作用[2]。

随着经济的发展和工业污染的加剧，土壤盐渍化面积日益扩大，加之对天然药物的不合理的采挖和开发利用，致使野生甘草资源遭到毁灭性的破坏，已远不能满足人们对市场的需求，发展甘草种植已迫在眉睫。我国有盐渍土地面积已达1亿hm2左右，其中潜在的盐渍化土壤约0.17亿hm2[3]。盐胁迫下，植物根系最早感受逆境胁迫信号，并产生相应的生理反应，继而影响地上部生长，盐胁迫常导致植物根系生长受抑制[4]。由于土壤盐渍化程度的不断加剧，已严重制约了我国药材产业的发展。土壤盐渍化是影响植物生长发育较为严重的环境胁迫之一[5]，杨秀红等[6]研究表明，NaCl浓度在50，100mmol・L-1时，甘草幼苗的生长和生理代谢基本正常，NaCl浓度达到200mmol・L-1时，部分生理生化指标明显出现异常，由此判断200mmol・L-1的NaCl浓度已对甘草已有相当程度的伤害。通常，植物通过抗氧化系统的作用抵御各种逆境胁迫[7]，也可以通过积累黄酮类物质提高植物抗氧化能力[8-9]。大量研究表明，多种外源物质如钙离子、甜菜碱、水杨酸等能够降低盐对植物的胁迫作用[10]。

近年来，应用外源物质减轻盐胁迫对植物的毒害作用成为抗盐研究中的一个热点。外源蔗糖和其它碳水化合物缓解盐对植物诸多生命活动的胁迫已有报道。如外源蔗糖对小麦幼苗耐盐性的影响[11]；外源蔗糖对盐胁迫荞麦幼苗根系生长的缓解效应[12]。蔗糖在植物细胞的细胞质中合成，在高等植物中，是主要的糖类物质形式，也是从叶片运输到植物体其他部位的主要糖类形式。此外，蔗糖是植物体内一种重要的信号分子，参与植物糖信号的传导及调控植物生长发育进程，并能调控某些基因的表达，如拟南芥中的ATB2基因[13]。有报道指出，蔗糖能减轻盐胁迫对植物的毒害作用，如外源蔗糖能显著缓解盐和热及盐热共同胁迫作用对菠菜PSⅡ颗粒的伤害，缓解其对光合作用的影响[14]。目前，有关甘草的研究大多集中于栽培技术、药理分析及临床应用等方面，对其抗盐碱特性及其机制的研究较少，尤其是外源蔗糖对盐胁迫条件下甘草幼苗根系生长及有效成分含量的影响方面鲜见报道。本试验通过施加不同浓度的外源蔗糖对200mmol・L-1NaCl胁迫条件下的甘草幼苗处理，来探究外源蔗糖对盐胁迫条件下甘草幼苗生长及有效成分含量的影响，以期为更好地开发利用甘草药用植物资源和盐碱地区能高产优质发展甘草种植产业奠定理论基础。

1材料

甘草G.uralensis种子采自甘肃酒泉甘草育种基地。将甘草种子播种于装有等量蛭石和草炭土的盆中，苗龄达30d后选取整齐一致的植株，作为试验供试材料。

2方法

2.1试验处理甘草苗子生长40d后作试验处理，共设8个处理，每个处理60株。在处理前每个处理对象随机抽取20株，在60℃下烘干至恒重称其干重。处理分别为CK1，浇灌等量的蒸馏水；CK2，浇灌浓度为200mmol・L-1的NaCl；T1，浇灌浓度为200mmol・L-1的NaCl+5mmol・L-1蔗糖；T2，浇灌浓度为200mmol・L-1的NaCl+10mmol・L-1蔗糖；T3，浇灌浓度为200mmol・L-1的NaCl+15mmol・L-1蔗糖；T4，浇灌浓度为200mmol・L-1的NaCl+20mmol・L-1蔗糖；T5，浇灌浓度为200mmol・L-1的NaCl+25mmol・L-1蔗糖；T6，浇灌浓度为200mmol・L-1的NaCl+30mmol・L-1蔗糖；每盆浇灌500mL的溶液，每隔3d浇灌1次，培养钵下面垫有托盘，以防盐溶液流失。待盐胁迫30d后取样，随机抽取20株在60℃下烘干至恒重称其干重。一部分样品于冰箱中用于测苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonia-lyase，PAL）的活性。其他样品于60℃下烘至恒重时测定根中总黄酮含量变化和甘草酸含量的变化。

2.2日相对生长量的测定将前后2次取的样先用自来水冲洗表面的泥土，再用蒸馏水冲洗干净。置于烘箱（型号GZX-GF101-4BS-Ⅱ）中，在105℃杀青15min，60℃烘干至恒重，称量其干重。日相对生长率（RGR）计算参照KingsbaryRW等的方法[15]，RGR=（ln处理后生物量-ln处理前生物量）/处理天数。

2.3PAL活性的测定选取植株相同部位的鲜样，参照薛应龙等[16]的方法提取与测定PAL，PAL活力（U・min-1・g-1FW）=A290×V1/（0.01×V2×T×W）；式中A为吸光度；V1为酶粗提液体积（mL）；V2为测定用酶液体积（mL）；T为反应时间（min）；M为样品鲜重（g）。

2.4总黄酮含量的测定将待测样用研钵研磨，精密称取0.2000g，参照余茜等[17]采用超声的方法提取和紫外分光光度法（仪器型号T6-新悦）测定根中的总黄酮，其回归方程y=0.010705x-0.00193，r=0.9999。吸光度在0.084～0.513与芦丁浓度之间存在良好的线性关系。总黄酮含量P={[（A+0.00193）×N×V]/0.010705×M×106}×100%；式中A为吸光度；N为稀释倍数；V为提取液体积（mL）；M为测定时所用质量。

2.5甘草苷、甘草酸含量的测定甘草苷、甘草酸含量的测定参照《中国药典》2010年版采用的方法提取与测定。采用Agilent1100液相色谱仪，色谱条件：HiQSiLC18W色谱柱（4.6mm×250mm，4μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸按药典的流动相配比进行洗；柱温40℃；检测波长237nm；流速0.8mL・min-1；进样量10μL。甘草苷对照品为中国药品生物制品检定研究院（生产批号111610-201005，纯度94.9%）；甘草酸铵对照品为中国食品药品检定研究院（生产批号110731-201116，纯度93.1%）。用上述对照品进行线性考察，以甘草苷对照品、甘草酸铵对照品的进样浓度（C）分别对其峰面积积分值（A）进行线性回归，得回归方程A=32.4243C+0.7573（r=0.9998）和A=24.0246C+0.6718（r=0.9999）。结果表明甘草苷对照品和甘草酸铵对照品进样浓度分别在14.28～75.02，25.8～119.67mg・L-1与其各自峰面积积分值呈良好线性关系。甘草苷含量P=[（A-0.7573）/32.4243]×V1×V2×0.949/M×1000；式中A为峰面积积分值；V1为提取液的体积；V2为稀释倍数；0.949为对照品含量，M为样品质量。甘草酸含量P=[（A-0.6718）/24.0246]×V1×V2×0.931×1.0207-1/M×1000；式中A为峰面积积分值；V1为提取液的体积；V2为稀释倍数；0.931为对照品含量；1.0207为甘草酸占甘草酸铵的比例；M为样品质量。

2.6数据处理以上各指标测定均重复3次，所有试验数据均采用SPSS软件进行误差和显著性分析（P

3结果与分析

3.1外源蔗糖对盐胁迫下甘草幼苗生长的影响CK2的日相对生长率低于CK1和T1～T6的日相对生长率，这说明在200mmol・L-1盐胁迫条件下，甘草幼苗的生长受到了抑制的，随着加入不同浓度的外源蔗糖，这种抑制作用在不断地减弱。当施加20mmol・L-1蔗糖时甘草的日相对生长率达到最大值，与CK1处于同一水平，见图1。当施加25mmol・L-1蔗糖时其日相对生长率又呈下降趋势。导致这一结果的原因有可能是高浓度的盐和外源蔗糖对甘草幼苗的根系造成生理性干旱所引起的，具体原因还待进一步探究。

3.2外源蔗糖对盐胁迫下甘草幼苗根系中PAL活性的影响外源蔗糖对盐胁迫甘草幼苗根系中PAL活性的影响见图2。经200mmol・L-1NaCl处理的甘草幼苗，根中PAL活性极显著下降，在施加5和10mmol・L-1蔗糖时PAL活性比单一盐胁迫下极显著升高，但未恢复到未受盐胁迫的水平。在施加30mmol・L-1蔗糖对盐胁迫下根中PAL活性受抑的缓解效应明显弱于5，10，15，20，25mmol・L-1蔗糖，表明蔗糖的此种缓解作用有浓度效应。

3.3外源蔗糖对盐胁迫下甘草幼苗根系中总黄酮含量的影响外源蔗糖对盐胁迫甘草幼苗根系中总黄酮含量的影响见图3，经200mmol・L-1NaCl处理的甘草幼苗根中总黄酮含量呈极显著下降，在施加5，10，15mmol・L-1蔗糖时甘草幼苗根中总黄酮含量比单一盐胁迫下显著升高，但未恢复到未受盐胁迫的水平。在施加30mmol・L-1蔗糖对盐胁迫下根中总黄酮含量缓解效应明显弱于5，10，15，20，

经相关分析结果表明，甘草幼苗根系中总黄酮含量与PAL活性呈正相关（r=0.9687）。PAL是植物合成黄酮过程中的关键酶，植物体内黄酮水平会随着PAL活性的增强或削弱而相应增加或减少[18]，图2和图3相对应的变化趋势也验证了这一点。

3.4外源蔗糖对盐胁迫下甘草幼苗根系中甘草苷、甘草酸含量的影响甘草苷含量的变化规律和总黄酮含量的变化规律相似，即经200mmol・L-1NaCl处理的甘草幼苗根中甘草苷含量呈极显著下降，在施加5，10，15mmol・L-1蔗糖时甘草幼苗根中甘草苷含量比单一盐胁迫下显著升高，但未恢复到未受盐胁迫的水平。在施加30mmol・L-1蔗糖对盐胁迫下根中甘草苷含量缓解效应明显弱于5，10，15，20，25mmol・L-1的蔗糖，表明蔗糖的此种缓解作用也有浓度效应。经CK1和CK2相比较，甘草幼苗根系中甘草酸的含量呈现极显著变化。在200mmol・L-1NaCl胁迫下，甘草幼苗根系中甘草酸含量明显下降。这有可能是植株中甘草酸的代谢不正常所造成的。在施加不同浓度的外源蔗糖后，甘草酸的含量回复至对照（CK1）水平。但蔗糖浓度的变化并没有引起甘草幼苗根系中甘草酸含量的变化。说明外源蔗糖对甘草幼苗根系中甘草酸的合成与积累响应不明显。但高浓度的NaCl会破坏甘草幼苗根系中甘草酸的合成和积累，这种胁迫效应极显著见图4～7。

1.甘草苷；2.甘草酸铵（图5同）。

4讨论

闫素芳等[11]认为盐胁迫对植物的伤害主要体现在以下几个方面：①吸水困难，土壤中盐分过多，降低土壤溶液的渗透势，形成生理干旱，造成细胞吸水困难，从而萎缩；②生物膜破坏及细胞内的大分子结构破坏，主要原因是盐胁迫可诱导植物体内产生大量的活性氧自由基（reactiveoxygenspecies，ROS），其中包括超氧阴离子自由基、羟基自由基、脂自由基、过氧化氢（H2O2）、单线态氧等，过量的活性氧自由基可以与脂膜、细胞色素以及蛋白质等发生反应，从而导致细胞膜系统被破坏，蛋白质及核酸等生物大分子变性，酶活性丧失，新陈代谢严重受到干扰，并最终导致细胞凋亡的发生；③生理代谢紊乱，钠离子与钾离子竞争细胞内酶的结合位点，细胞内有超过50种酶是被钾离子激活的，而钠离子没有这种作用。

本研究表明，在施加不同浓度的外源蔗糖时，甘草幼苗的日相对生长率呈现出不同的变化规律，甘草幼苗根系中总黄酮含量和PAL活性的变化也呈现出不同的变化规律，这说明一定浓度的外源蔗糖对盐胁迫下甘草幼苗的生长具有一定的缓解效应。由甘草幼苗根系中总黄酮和PAL活性的正相关（r=0.9687），可以认为外源蔗糖对盐胁迫下甘草幼苗根系生长的缓解作用在很大程度上与PAL活性的增强及其导致的黄酮含量的增加有关，当外源蔗糖的浓度10mmol・L-1时，甘草幼苗根系中PAL的活性达到最大值，当外源蔗糖的浓度为15mmol・L-1时，PAL的活性又成下降趋势。表明外源蔗糖对甘草幼苗根系中PAL和总黄酮的缓解作用具有浓度效应。甘草苷含量的变化规律跟总黄酮含量的变化规律相似，原因是甘草苷属于黄酮类物质。在200mmol・L-1NaCl胁迫条件下，甘草酸含量呈极显著降低，这可能是植株中甘草酸代谢不正常造成。在200mmol・L-1NaCl胁迫条件下施加5mmol・L-1的外源蔗糖时，甘草幼苗根系中甘草酸含量恢复至最初（CK1）水平，缓解了盐对甘草幼苗的胁迫作用。但不同浓度梯度的外源蔗糖变化并没有引起甘草幼苗根系中甘草酸含量的变化。说明外源蔗糖对甘草幼苗根系中甘草酸的合成与积累响应不明显。

综上所述，外源蔗糖可削弱盐胁迫对甘草幼苗生长的抑制效应，甘草幼苗根系中甘草酸得以积累。与盐胁迫相关的总黄酮含量变化和PAL活性的变化规律与之相呼应也说明了这一点。

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