浓缩生长因子在骨组织再生和修复上的作用研究进展

骨组织再生过程发生异常会导致骨量或骨质结构的改变。而临床中涉及骨组织再生的领域甚多，如：骨折的修复重建、骨肿瘤术后骨缺损的修复，尤其在种植外科领域中齿槽嵴的增高、上颌窦提升术、种植体植入后周围支持骨的修复所涉及到的骨组织再生和修复问题是近年研究的热点之一。因此，深入研究骨组织再生和修复的过程，对于临床应用具有十分重要的意义。新一代的血浆提取物-浓缩生长因子（CGF，Concentrate Growth Factors），在骨组织再生和修复中的作用越来越引起人们的关注。本文就浓缩生长因子在骨组织再生和修复上的作用研究进展综述如下。

1 CGF的发展史

50年前醋酸纤维素过滤器被用于神经和肌腱再生实验[1]，Murray等[2]在狗的腿骨缺损区应用一种塑料支架，这种方法促使缺损区有大量新骨生成。Hurley等[3]在兔子和老鼠的颅骨缺损区安放机械屏障也有成功的骨再生效果[4-5]，这些研究提供了大量的证据，表明机械屏障能阻止软组织进入骨缺损区，显著提高骨再生和修复。然而，大多数早期研究者的成功归功于他们意识到屏障膜的保存及保护血凝块的作用，但没有意识到屏障膜为成骨细胞创造了独立封闭的空间。1982年，Nyman[6]第一次把屏障膜技术用于牙周病的治疗获得成功，并提出了引导组织再生（Guided Tissue Regeneration，GTR）的概念，其后GTR技术成为牙周病治疗的一项常用手段。1993年，Buser等[7]提出了引导骨再生的概念。现在，GBR技术已被广泛应用在牙槽外科、牙周科和口腔种植领域。在GBR技术中各种骨替代材料与血浆提取物的混合使用在目前的临床应用中被广泛使用。而血浆提取物的研究大致经历了Platelet-rich plasma（PRP），Platelet-rich fibrin（PRF），Concentrate Growth Factors（CGF）三个阶段。1984年，Assoion等[8]发现了人血浆中提取的富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）中含有多种生长因子，当PRP与氯化钙以及牛凝血酶混合后，各种生长因子即从血小板中的α颗粒中释放出来。它是一种自体来源的通过梯度离心获得的富含血小板衍生生长因子和转化生长因子β等的血浆提取物[9]。1993年，Hood等[10]提出了PRP凝胶（PRPgel ）概念，亦即血小板凝胶（platelet gel）。PRP gel是纤维素凝胶的一种改良应用，由自体全血离心产生PRP，然后与凝血酶和氯化钙混合而成的一种具有粘性的胶状凝块。PRP凝胶与纤维素凝胶最本质的区别是PRP凝胶含有高度浓缩的血小板及其固有的浓缩的纤维素原。血小板被凝血酶激活，释放出一系列的因子而发挥其作用。PRP凝胶最初被作为一种生物凝胶和屏障膜而应用于临床[11]。1997年，Whitman率先将自体的PRP应用于口腔临床研究中并取得了良好效果，随后PRP技术成为口腔种植骨缺损修复和骨整合研究中的热点[12]。目前，对于PRP的研究和应用还存在较大争议。主要集中在PRP的确切作用机制、PRP能发挥作用的剂量、PRP的安全性问题、PRP能否引起感染等[13]。

作为第二代浓缩血小板，富血小板纤维蛋白（PRF）是由Choukroun首次引入的[14]。PRF是富纤维蛋白凝胶，由患者静脉中抽取的新鲜血液制作而成，属于新一代的血小板浓缩物，它制备简单无需任何生物添加剂的处理。它缓慢的聚合似乎形成了类似自然的纤维网络。在PRF通过离心分离的制备过程中，血小板被激活的同时大量脱颗粒细胞中蕴含的重要的生长因子释放出来，在对PRF进行加工的同时白细胞也隐藏在细胞因子中，对炎症和止血起到作用，并且加速组织愈合和血管生成，组织学评估表明PRF能够缩短骨形成时间[15]。PRF方案无需凝血酶之类的化学添加剂即可制成凝胶状物体。因此，PRF无交叉污染之忧。浓缩生长因子（CGF）是Sacco首次开发出来的[16]。与PRF一样，CGF由静脉血分离制作而成。不过，该技术的离心速度有所不同。CGF是一种具有完全独特属性的愈合型生物材料。外科医生可以将CGF作为隔膜来加速软组织愈合或与骨移植物混合，以加快新骨重建。CGF无需任何化学或过敏性添加剂（如：凝血酶或抗凝剂），因此，不会引起病毒性传染病。

2 CGF的基本原理和分离技术

2.1基本原理：CGF血纤维蛋白分子结构为三键式联结，呈立体网状结构，可有效地滞纳血小板及各种循环分子（如细胞因子）。当CGF应用于损伤的组织时，通过引导损伤组织的再血管化，免疫调节以及捕获循环血中的干细胞，最终促进组织愈合再生和修复。

2.2分离技术：将患者的静脉血采集10ml于试管中，并立即放入Medifuge（Silfradent，意大利）离心加速机分离处理。设定制备CGF程序，旋转12min后，可见试管中分为三层（最上层为细胞质，中间纤维蛋白凝结物即CGF，底层为红细胞及血小板），将血清分离出来，并存储在特定的存储器皿中。CGF被分离出来（其中大量的生长因子位于中间层与底层的界面上，所以分离的时候应一并分离出来），并存储在稀释的抗菌溶液中（Lincocin 600mg）。底层的红细胞部分及血小板立即存储在器皿中，其中富含红细胞、血小板以及铁、钙和其他基本元素、可以用来制备截骨术中的填料，以便混合生物材料及自体骨。将CGF切割成1～2mm的微粒，随后依次与收集的红细胞部分和骨代材料混合。为增加混合物的柔软度，可添加一些血清。使用特定的收集设备（Silfradent 意大利）旋转6s左右将其混合并搅匀。另外，CGF具有极大的可模制性，通过压缩，以薄膜的形式使用，也可以将其撕裂，以碎片的形式使用。

3 CGF的主要成分及生物学特性

CGF是一种修补生物材料，其中含有浓缩生长因子及纤维蛋白，具有改善并增强组织再生的独特性质，是再生医疗领域中组织刺激的新技术。CGF技术是以患者自身静脉血为原料，通过梯度密度离心的方法，将其分为血浆细胞活素类、血小板、活性纤维蛋白、粒性白细胞、浓缩生长因子、抗体，再单独或联合其他生物材料注入硬组织缺损或软组织创伤处，从而修补缺损，诱导生长，加速局部创伤的愈合并提高愈合质量。其中的浓缩生长因子包含：转移生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、骨形成蛋白（BMPs）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）以及成纤维细胞生长因子（FGF）等[17-18]。CGF具有柔性成型血凝块及弹性有机纤维蛋白网格，促进血管生成及移植物存活，从血小板及浓缩纤维蛋白中释放出的生长因子的生物学特性，并具有修复促进和调节功能。

4 CGF在创口愈合过程中的作用

创口愈合过程可分为三个不同的阶段：生化活动阶段、细胞活动阶段和细胞反应阶段[19]。生化活动阶段即把机械损伤转化为机体能接受的生化信号，这一反应是由血清中的Hagemann因子启动的。当机体受损伤后，创缘间充以血液和含有纤维蛋白的渗出液，并迅速凝集成块[20]，而血清中的Hagemann因子则引起局部微循环障碍，血浆与组织蛋白和基底膜接触，这样便激活了Hagemann因子和血循环中的血小板。被激活后的Hagemann因子反过来再促进上述反应进一步生成，并导致细胞活动开始，在组织内出现白细胞和巨噬细胞浸润，并侵入血块将死亡的细胞，可能存在的细菌及无活力的组织吞噬消化，凝血反应产生纤维素促进止血，凝血酶则引起血小板a粒子的释放。补体系统产生许多生物活性分子，包括C5a、CD34，对中性粒细胞和单核细胞起趋化吸附作用。同时，血浆中的血浆酶降解纤维素，得到的纤维素降解产物是一种自我活化的生物分子，可使单核细胞迁移和血管舒张。在此阶段中，CGF通过血小板释放各种生长因子，促进产生新的血管，引导损伤组织进行再血管化，进行自身的免疫调节以及捕获循环血中的干细胞（全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞），使细胞移到缺损区。细胞反应阶段开始作用主要靠组织细胞、成纤维细胞渗入血凝块，组织细胞可分化为成纤维细胞，具有胶原的能力，血浆和血细胞因子起到修复、消炎和止痛作用，血小板传递信号，释放最重要的PDGF，TGF-β和IGF-1生长因子，使局部的间叶细胞、上皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞等相关细胞进行迁移、分化和增殖。在细胞反应的最后阶段，单核细胞转化为巨噬细胞，并辅助中性粒细胞加强机体防御，促进创口愈合。

5 CGF的临床应用

许多临床报道表明，CGF在口腔颌面外科下颌骨缺损重建、齿槽嵴增高和上颌窦提升术、种植外科领域的骨组织修复重建中起积极的促进作用。Corigliano[21]报道1例36岁男性患者，╂出现肿胀和复发性瘘管。X光照片显示整个牙周区存在根尖病变。患者身体健康，由于其牙周发生病变，我们决定拔除牙齿并植入修复性压根。接着，从患者的前臂采集8份血样，按照CGF方案用Medifuge（Silfradent，意大利）进行分离处理。麻醉之后，小心地将牙齿拔除，避免伤及残存的皮层。然后深入牙根尖2mm探查骨的状况，以非常慢的速度实施截骨术，此过程不使用水。接着植入修复性牙根，拔牙后留下的种植体空间为4.7mm×15mm。随后用纤维蛋白微粒和自体骨（截骨术过程中采集）以及凝块的混合物填充牙根修复体和牙槽骨之间的空隙。随后用一些交叉的纤维蛋白膜填补拔牙后形成的牙槽空洞，以便恢复受损的组织。此过程将保护并刺激伤口，因为它将移植物隔离，另外，由于纤维蛋白具有一定的光强度，能传输骨膜和周围的GF释放的愈合信号，有利于伤口愈合。手术完成后，用复合材料对牙冠进行粘接，已达到美观的目的。在15、30、45天对患者进行X光检查，60天后骨再生完成，可对患者实行牙冠修复治疗。Dong-Seok等[22]将CGF用于上颌窦提升术，同时CGF隔膜用于引导组织再生。最近许多报道亦表明，CGF可以跟骨粉混着使用，加速骨细胞生长；也可以直接铺在缝合伤口内，让伤口愈合速度增加约五倍，直接填充CGF以形成骨。某男性患者来我院以“外伤后牙槽骨缺损”就诊。其上颌右上┼缺失，牙槽嵴高度降低，周围牙龈无红肿压痛；┼松动I°，无叩痛，牙体伸长偏颊侧，咬合关系不良；右下┼缺失，牙槽嵴呈刃状。经X线检查后，诊断为严重的垂直和水平骨重吸收。因此，决定拔牙后实施骨移植再生手术。我们使用了自体骨（从髂骨提取）Bio-oss，与CGF碎块进行混合，并根据覆盖面积制CGF膜。由于骨原细胞浓缩液、生长因素、细胞因子和纤维蛋白及其促使活性细胞陷入CGF的结构，也由于Bio-oss的骨传导性，CGF与自体骨、Bio-oss和血液混合后能在单一手术中完成干预工作。用CGF进行治疗的所有临床病例中，骨和软组织再生的情况良好，而且时间缩短一半。伤口具有极强的抗感染能力，降低了术后发生细菌感染的风险。膜层中添加的CGF可形成一道坚固的屏，它使用方便，具有较强的粘合力和浸透性，值得临床推广应用。

6 问题与展望

CGF来源于自体本身，无毒性和免疫原性，不会存在免疫排斥反应，简单而费用低廉的方案，基于自然生物机制。CGF具有促凝血作用，能够促进组织的再生，加速缺损区的愈合。CGF和新鲜的活体自体骨的混合对骨再生最为理想。这就是CGF成为目前的可靠技术的原因，CGF与其他所有血小板浓缩液（特别是PRP）的不同在于其提取技术，而且除血液外，它无需添加任何合成或催化成分即可促进血液转型（PRP需要添加牛凝血酶和氯化钙）。CGF其制备工艺、生化特性、结构、凝结物组成、纤维蛋白结构、血小板细胞因子作用、白细胞活化作用、CGF和骨细胞间可能的相互作用、用于软组织和骨再生的可能性，这些因素使得CGF成为一种发展迅速的生物材料，临床应用安全，其应用前景应十分广阔。

CGF具有浓缩生长因子的促生长和愈合能力，有利于所有再生组织的恢复。尽管CGF具有如此多的优点，但在进行引导骨再生的过程中仍然需要与自体骨或骨代材料混合来加速骨再生速度，这样做增加了术区或引起一些并发症。若能仅用CGF而无需与自体骨或骨代材料混合来促进成骨，将是未来的一个研究方向。CGF含有高浓度生长因子的凝胶状纤维蛋白块，由在制造过程中血小板释放出的高浓度生长因子激活。应用在需要再生的组织上，显著地加速修复过程。因此，浓缩生长因子（CGF）为骨组织再生和修复提供了新的思路，也为应用骨再生方法治疗颌面部骨组织缺损提供了新的理论依据。

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[收稿日期]2012-08-20 [修回日期]2012-10-09