减毒鸡白痢沙门菌aroA株的构建与致病性分析

摘要：以鸡白痢沙门氏菌c79-3强毒株为亲本，通过λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株aroA，并进行了测序验证和毒力试验。结果表明，aroA基因缺失株的生长速度较亲本株缓慢，且该缺失株具有良好的遗传稳定性；相比野生菌株，aroA基因缺失株的毒力发生了下降，雏鸡攻毒死亡率较亲本株低。本研究获得的减毒鸡白痢沙门氏菌aroA基因缺失株aroA，为进一步研究鸡白痢沙门氏菌aroA基因的功能和后续减毒活疫苗开发奠定了基础。

关键词：鸡白痢沙门氏菌；λ-red同源重组；aroA基因；生物学特性；活疫苗

中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6195-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.23.049

Abstract：The aroA mutant was constructed by the λ-red recombinant based on c79-3 virulent strain and was confirmed by PCR and sequencing. The growth characteristics and genetic stability of the mutant strain was tested. The results showed that the growth rate of aroA mutant was slow than the parent strain and was stable. The pathogenecity tests on one day-old chicks. The results showed that compared with wild strains， the virulence of aroA gene deletion mutant was decreased， and the attack rate of chicken was lower than that of the parent strain. In conclusion，we successfully obtained aroA mutant strain and this study provided basic data for further study of the functions of the aroA gene and live attenuated vaccine.

Key words： Salmonella pullorum； λ-red recombinant system； aroA gene； biological characteristic； live vaccine vector

沙T氏菌属包含2 500多种血清型，其中包括了肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等人畜共患血清型以及具有宿主高度专一性的鸡白痢沙门氏菌血清型。鸡白痢（pullorumdisease，PD）是由对家禽具有高度的适应性的鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum）引起的一种多发性传染病[1]。鸡白痢沙门氏菌可水平传播，易感染三周龄以下的雏鸡，且有较高的致死率[2]。此外，它还能持续感染脾脏和生殖道数月时间，引起产蛋和后代的垂直感染[3]。鸡白痢在发达国家已经被根除，但仍在世界范围内特别是发展中国家引起巨大的经济损失[4，5]。鸡群长时间高水平感染和抗生素滥用导致细菌的耐药性持续增加，导致鸡白痢更加难以控制。一个好的控制鸡白痢沙门氏菌感染的方法有巨大的应用前景[6]。

疫苗的应用也能很好的控制和预防沙门氏菌的感染[7]。目前在国际上得到应用的沙门氏菌疫苗主要有鸡伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡肠炎沙门氏菌苗等。在欧洲禽类养殖国家，沙门氏菌疫苗的应用在防治沙门氏菌感染方面起到了非常重要的作用。许多研究表明减毒活疫苗的效果要优于灭活苗，由于沙门氏菌是一种兼性胞内寄生菌，特异性细胞免疫是控制它的关键。与灭活苗相比，减毒活疫苗能优先刺激机体产生细胞免疫，具有更高的效率[8]。然而在中国，尚未有自主研发且匹配中国流行菌株的沙门氏菌疫苗产品。因此，研发针对鸡白痢的减毒活疫苗对中国禽类养殖具有重大意义。本研究以野生强毒株C79-3为亲本，通过λ-red同源重组系统[9，10]构建芳香族氨基酸合成相关基因aroA缺失株aroA，达到干扰细菌代谢，降低毒性的效果，从而为研发更加安全有效的减毒活疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、试验动物

鸡白痢沙门氏菌强毒株c79-3；Red同源重组所需质粒pKD3、pKD46、pcp20由扬州大学彭大新教授馈赠；1日龄白来航雏鸡由购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF鸡胚自孵。

1.2 主要试剂和培养基

甘油、氨苄青霉素（Ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）购于美国Sigma公司；普通Taq DNA聚合酶、PrimerSTAR Max DNA高保真聚合酶、DN段回收试剂盒、DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司；LB肉汤/琼脂培养基为美国BD公司产品。

1.3 鸡白痢沙门氏菌aroA基因缺失株构建

1.3.1 引物设计 参考Genebank中的鸡白痢沙门氏菌（NC_011274）aroA基因序列，用Primer 5设计一对敲除引物Aro1和Aro2（表1）。其中，Aro1由 56 bp的aroA基因上游同源序列A1和扩增质粒pKD3氯霉素抗性基因的上游引物C1（下划线所示）组成，Aro2由57 bp的与aroA基因下游同源的序列A2和扩增质粒pKD3氯霉素抗性基因的下游引物C2（下划线所示）序列组成。另外，从aroA基因两侧设计引物P1、P2；aroA基因中间设计上游引物P3和下游引物P4，如表1所示，用于aroA基因缺失构建过程中的PCR验证。

[7] LIU H， CHEN L， WANG X，et al.Decrease of colonization in the chicks' cecum and internal organs of Salmonella enterica serovar Pullorum by deletion of cpdB by Red system[J].Microb Pathog，2015，80：21-6.

[8] DARWIN K H，MILLER V L.Molecular basis of the interaction of Salmonella with the intestinal mucosa[J].Clin Microbiol Rev，1999，12（3）：405-428.

[9] MUNIYAPPA K，RADDING C M.The homologous recombination system of phage λ. Pairing activities of β protein[J]. J Biol Chem，1986，261（16）：7472-7478.

[10] POTEETE A R.What makes the bacteriophage λ Red system useful for genetic engineering：Molecular mechanism and biological function[J].FEMS Microbiol Lett，2001，201（1）：9-14.

[11] 郭|春，卢 艳，刘家森，等.多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株的构建及鉴定[J].微生物学报，2012，52（4）：526-531.

[12] HOMCHAMPA P，STRUGNELL RA，ADLER B.Molecular analysis of the aroA gene of Pasteurella multocida and vaccine potential of a constructed aroA mutant[J].Molculer Microbiology，1992，6（23）：3585-3593.

[13] MALCOVA M，KARASOVA D，RYCHLIK I. AroA and aroD mutations influence biofilm formation in Salmonella Enteritidis[J].FEMS microbiology lett，2009，291（1）：44-49.

[14] SEBKOVA A，KARASOVA D，CRHANOVA M，et al.Aro mutations in Salmonella enterica cause defects in cell wall and outer membrane integrity[J].J Bacteriol，2008，190（9）：3155-3160.

[15] 杨 林.沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA缺失株的构建[D].江苏扬州：扬州大学，2014.