胚胎干细胞在心血管疾病治疗的初步研究

胚胎干细胞(ESC)是一种多潜能细胞，可在体外培养时保持未分化状态，并具有分化为特定体细胞的潜能，包括心肌细胞。ESC可提供大量分化的心肌细胞用于使受损的心肌层再生的治疗。目前ESC在心血管疾病治疗方面的研究仍处于基础环节，现将相关问题作一综述。

成年心脏心肌的再生能力有限，发生器质性损伤后，常导致不可逆的心脏功能减退。目前，药理、介入、外科等方面的治疗效果仍十分有限。ESC具有强大的分化潜能和增殖能力，能定向分化为结构、功能典型的具有收缩能力的心肌细胞，用于治疗心血管疾病有良好的前景。这一方面的研究目前还处于较基础的环节。

1 ESC可向心肌细胞分化

ESC主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑堪胚之前的早期胚胎细胞，经体外培养可以分化为心肌细胞。Kehat[1]对由鼠ESC（mESC）分化的心肌细胞进行了一系列鉴定：免疫组化染色显示α-MHC、α-actinin、cTnI、desmin、ANP等心肌特异蛋白都有表达；RT-PCR提示心脏特异的基因cTnI、cTnT、GATA4、human ANP、MLC-2A、MLC -2V、Nkx2.5和α-MHC特异表达；电镜观察到缝隙连接和桥粒，并且随着培养时间的延长，细胞内肌小节排列渐趋整齐；电生理也显示了典型的兴奋收缩偶连反应。Baharvand等[2]则进行了体内、体外分化情况的对比研究进一步支持了其定向成熟分化。Laura等[3]将人胚胎干细胞（hESC）体外诱导分化的心肌细胞，培养观察了达3个月，并通过膜片钳等技术来评估其功能成熟情况，以RT-PCR来评估编码离子通道的亚基的表达；可发现随着体外培养时间的延长，ESC分化的心肌细胞愈接近成熟心肌细胞表型。

2 定向诱导ESC向心肌细胞分化

ESC 体外分化为心肌细胞，一般采用胚胎体(EB)形成法，而EB自然分化得到的心肌细胞比较少，约5％[4]。大量的研究[5]认为转化生长因子（TGF）、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白(Wnt families)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及全反式维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和垂体后叶素、维生素C、5-氮胞苷等可以促进ESC分化为心肌细胞。血清的影响近年来也受到重视， Passier等[6]采用无血清培养基诱导胚胎干细胞，发现心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍，如果在培养体系中加入维生素C，分化效率还可以再提高40％；Pal等[7]则发现低浓度血清(5%)维持及有BMP-2(25 ng/ml)的共同作用下，有利于人胚胎干细胞株BG01V和ReliCell((R))hESC的分化。除了提高心肌细胞在胚胎干细胞分化群落中的比例，Wang等的研究[8]发现旋转的细胞培养系统不但利于ESC分化形成EB，且分化得的心肌细胞成熟度优于普通悬浮培养，并能在3D胶原支架上形成组织。

3 纯化已经分化的心肌细胞

ES细胞可分化为心房肌、心室肌、房室结、蒲肯野细胞和窦房结样细胞。多种心脏细胞类型的混合物移植后，很可能导致心律不齐，不利于长期心功能的维持；纯化分化的心肌细胞，是临床应用的前提。MLC-2v启动子可特异地使心室相关基因表达，Muller等为ESC构造了CMVenh/MLC-2v启动子，使增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达，通过FACS筛选阳性细胞，特异地纯化了心室肌细胞，基本除去了心房肌细胞，但纯化生产大量ES细胞源心室样心肌细胞仍是ESC应用于心血管疾病治疗的一大障碍。目前hESC向心肌细胞诱导分化率较低，而且仅有早期心肌细胞的结构和特性，尚未建立有效的筛选纯化技术。有研究提出可通过添加细胞因子，经Percoll密度梯度离心分选获得，但经此分选后的心肌细胞活性肯定受到很大影响，体内是否具有参与心脏重建功能还有待验证。

4 移植细胞的选择

ESC的治疗属于细胞移植治疗，尚在摸索阶段。用未分化的ESC进行移植是一种探索，早期研究发现未分化的ESC进行移植，可改善心功能；近年Nussbaum等[9]的研究发现未分化的鼠胚胎干细胞不适合移植治疗，无论是在正常或是有梗死发生的心脏，不仅没有明显的心肌细胞分化，而且会形成畸胎瘤和发生免疫应答；故认为应该进行定向诱导后再用于移植治疗。

5 移植途径的选择

目前的实验中有以下移植途径：（1）经静脉移植:冠状动脉血流量约占心排血量4％，经静脉移植效率十分低下。在心肌梗死急性期，大量炎性介质释放使梗死区及周边毛细血管通透性增加，这可能使干细胞经冠状动脉移植成功，但此期心肌炎症反应较强，又容易导致移植细胞死亡。（2）心肌内注射:通过特制的针进行心肌内注射，靶部位可以是正常心肌、梗死边缘带或是以上二者的联合，适合与冠状动脉搭桥术同时进行，目前仅用于动物实验。（3）心内膜心肌内注射:心脏自动导航系统能够实现经心内膜心肌内注射，创伤小、安全性高，但移植细胞可随心脏运动从针孔溢出，无法均匀分布，可能造成移植后心室运动的不协调；且注射部位、注射剂量以及移植细胞在损伤心肌中的生存条件还需要进一步阐明。找到高效、安全的移植途径是临床应用前必须解决的问题。

6 移植免疫

细胞的免疫原性主要是由I型主要组织相容性抗原（MHC I)介导的。hESC虽然只表达低水平的MHC I类抗原，但移植治疗时仍存在移植排斥反应。目前提出了一些解决ESC移植排斥反应的可行途径：（1）体细胞核转移(SCNT)：即治疗性克隆技术。将患者的体细胞核移入去核的卵母细胞中，体外培养形成含有患者遗传信息的ES细胞系，再将其诱导分化成特定细胞（如：心肌细胞）进行移植。（2）通过转基因技术向ESC转染患者组织相容性抗原(MHC I)基因。（3）建立ESC细胞库，将具有不同组织相容性的ES细胞系冻存建库。（4）通过基因敲除去ESC的MHC基因，建立可共用的供体ESC细胞系。此外，有研究者提出把ESC分化的多能造血干细胞移植到已去除T细胞的受者体内，使受者和供者干细胞形成嵌合体，新生成的T细胞将对移植的心肌细胞形成特异的免疫耐受，达到稳定的中枢清除性耐受，这样受者无需事先进行免疫抑制。Fandfich等直接用大鼠胚胎干细胞(RESC)打入MHC配型不符的大鼠门静脉，发现可形成稳定的造血干细胞嵌合体，并成功地诱导对移植心脏的耐受。其具体机制还不清楚，可能是因为RESC不表达免疫刺激因子，不能触发T细胞的反应；另外RESC表达FASL，与带有FAS的免疫细胞接触后触发免疫细胞的凋亡 。近年有研究[10]发现在有免疫活性的小鼠体内移植ESC未观察到免疫耐受或淋巴嵌和现象，但观察到有免疫赦免，会允许ESC形成畸胎瘤。

7 安全性评价

由ESC分化的心肌细胞移植到体内后可能受到局部微环境信号的影响发生变化，目前尚无一个统一的标准对细胞发生的恶性转化加以确定，有必要进行多项指标的评估：（1）形态学特征的改变。（2）刀豆球蛋白A(ConA)凝集试验观察细胞表面结构的改变。（3）锚定非依赖性生长(AIG)。是细胞癌前转化的特征，同时也是检测细胞恶性转化的重要指标。（4）染色体核型分析。（5）动物体内成瘤性检测。Koch等[11]发现由ESC形成的肿瘤部分地受控于补体的旁路途径，对补体的易感性也是与ESC形成肿瘤的能力相关的； Behfar等[12]发现TNF-α这种程序重排细胞因子在体内可以促进ESC向心肌细胞的分化，这种作用也许可以抑止ESC在分化中发生肿瘤。建立严格控制的标准化干细胞培养体系对于保证干细胞生物学特征的稳定及增强移植的安全性具有重要意义。移植后长期的安全性评价很少，有待于进一步研究。

8 ESC移植治疗的动物实验

Min等将小鼠ESC分化的心肌细胞用GFP基因进行转染，然后移植到梗死的大鼠心脏，于第六、三十二周观察，免疫荧光证实GFP基因在心脏表达，植入区的毛细血管增加且大鼠的存活率提高，这说明移植的细胞能长期存活，并保持良好的功能状态[13]。Yang等将血管内皮生长因子（VEGF）基因转入ESC，这种转基因的ES细胞在体外诱导分化后移植到梗死的心脏，显著增强了心脏的收缩力，免疫组化显示梗死区域新生血管大量形成[14]。ESC源性心肌细胞移植后促进心功能的恢复，得益于有功能的心肌细胞取代了疤痕组织，使梗死面积减小，减少了梗死局部心肌细胞的凋亡[15]，也使正常心肌组织过度牵张程度降低，保护了其收缩功能。另外，移植细胞可以释放一些心脏保护因子，如VEGF等，促进心脏功能的更好恢复。但是，移植细胞能否完全整合入心脏组织，是否导致心律失常以及远期后遗症等问题还有待研究。现在的实验研究多基于啮齿类动物，相对较短时间内观察到心功能改善，在更长时间内的效果及在大型动物和灵长类的实验模型涉及尚少。故在评价动物模型时，应该注意基因表达、细胞信号途径、物种体内生物学环境等方面的差异，注意实验室结果与临床实践运用的差异性，对其临床运用的可能给予恰当评价。

ESC不可避免地需要来源于胚胎组织，我国学者赞成以维护和提高人类健康为目的的hESC研究，强调必须严格、审慎，坚持伦理原则，严格控制使用人为配子制造的胚胎和克隆人的胚胎。作为当今医学生物技术研究的前沿领域，ESC在心血管疾病治疗方面的研究必将为心血管疾病的治疗展开新的篇章。

参考文献：

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收稿日期：2007-10-22 修回日期：2007-11-01