以DSS致小鼠溃疡性结肠炎为动物模型呼吸道SIgA为检测指标探讨“肺合大肠”理论的相关途径

摘要：目的：从黏膜免疫角度探讨“肺合大肠”理论的具体相关途径，丰富“肺合大肠”理论的内涵。为溃疡性结肠炎的治疗，提供新的思路。方法：以DSS致小鼠溃疡性结肠炎为动物模型，检测模型组与空白对照组呼吸道灌洗液中分泌性IgA(sIgA)的含量。结果：模型组与空白对照组分泌性IgA(SIgA)含量经统计学处理后，无统计学意义。结论：①本次动物实验设计丰富了“肺舍大肠”理论的实验研究方法；②实验结果可能和3种因素的影响有关；③通过本实验探讨动物实验方法存在的问题；④该实验的启示。

关键词：“肺合大肠”理论；DSS致小鼠溃疡性结肠炎；分泌性IgA；动物实验研究

中图分类号：R－33　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2007)05-0976-04

“肺合大肠”《灵枢・本输》理论属中医藏象理论中脏腑相合理论，从解剖距离看，肺与大肠是五组相合脏腑中距离最远的一组，其理论意义更能反映中医理论宏观性和整体性的特征。自“肺合大肠”理论在《内经》中确立以来，备受历代医家重视，至今仍具有很高的临床价值，人们不断尝试着从理论、临床应用和实验等不同角度对其进行研究。从上世纪80年代初期开始，医学工作者开展了一系列关于肺肠相合理论的动物实验研究，大多以肠到肺的途径作为切入点，实验模型以便秘动物模型为主，如王今达等通过钳夹肠系膜上动脉观察肺部表现[1]，冯学瑞等制作大鼠直肠全结扎模型观察肺部指标[2]等等，其研究成果从一定角度反映了肺肠的相关性。此次实验在以往研究的基础上，突出肺肠相合具体途径的探讨。

1　材　料

1．1　动物　8～9周龄BALB／c雄性小鼠，体重16～18g(第四军医大学实验动物中心提供)20只。

1．2试剂　sIgA放免试剂盒，北京原子高科核技术应用股份有限公司国家同位素工程技术研究中心提供。

1．3药物　葡聚糖硫酸钠(DSS)，Sigma公司生产，相对分子质量5000，硫磺含量为15．0％-20．0％，制成5％DSS水溶液，使用当日配用。

1．4仪器　SN－682型放射免疫r计算器(上海核福光电仪器厂生产)。

2　方法

2．1　动物分组　随机分为正常对照组8只和模型组12只。

2．2动物处理　普通饲养环境，通风。以组为单位饲养，实验室干表温度在25―30℃，湿表温度19―21℃，相对湿度35％－47％，适应性喂养1周后给小鼠称重。

2．3造模方法　用5％DSS水溶液给模型组小鼠自由饮用。

2．4标本获取　模型制作第7天，分别对模型组和空白对照组小鼠称重。去眼球放血处死小鼠，固定，开胸，以1．5mL生理盐水注入气管，轻轻按摩肺组织30s后抽回灌注液体。再灌注该液体，反复抽注3次，最后将灌入的液体抽出，为一次灌洗完毕。同法操作共3次，将全部灌洗液收集在一起。即刻送往陕西中医学院附属医院核放射科冷冻。

2．5观察及测量方法　观察两组小鼠的大便及精神状态；采用放射免疫法测定肺泡灌洗液中sIgA含量，单位以mg／mL表示。

3　结果

3．1动物的一般表现　于造模第4～5天，模型组小鼠均出现不同程度的腹泻症状，与对照组相比，便质不成形。

3．2呼吸道分泌液中8IgA的检查结果　结果见表1。表1模型组与空白对照组肺泡灌洗液中SlGA含量(x±s)

数据统计，先用F检验作方差齐性检验，统计结果PO．1，按a=0．1水准，不拒绝Ho，无统计学意义。对两组小鼠实验前后体重做统计学处理结果P>0．1，按a=O．1水准，不拒绝Ho，无统计学意义；实验处理后两组之间体重的统计结果亦无意义。

4　讨　论

本次动物实验结果模型组与空白对照组的sIgA含量差异性不大，鉴于各种主客观因素的影响，此次实验结果虽无法支持原先的实验设计目标，但不能否定其实验设想，其意义在于丰富了此理论的实验研究方法，并成功提取了小鼠呼吸系统灌洗液，为后续实验提供了可借鉴的经验。

4．1　实验模型与指标的选择　①动物模型的选择：实验方法在医学研究中常表现为两种形式：临床试验――人体试验和动物实验――模型试验。在哲学家那里，实验被认为是“试图驳斥某种假说”的方法，而经济学家将其刻画为“一种最终受益难以评估的臆测性投资”，这些观点是对实验不同侧面的不同概括而已，作为一种认识世界的实践活动，实验方法在医学工作者认识人体、解决问题的实践中扮演着重要的角色。

回顾有关“肺与大肠相表里”理论机理实验研究的动物模型，其演化旨在模拟临床燥屎内结、阻塞大肠、腑气不通引起肺气上逆的病理过程。王今达等[1]用钳夹肠系膜上动脉模型与钳夹一侧肾动脉与股动脉模型作比较，观察到钳夹肠系膜上动脉的动物都出现了肺脏严重损伤(如充血水肿、片状出血、肺不张)，而其他脏器(心脏、肝脏、胰脏、肾上腺和肾脏)均无肉眼及镜下异常，且钳夹股动脉、肾动脉并不造成肺及其他脏器的损害。说明缺血性肠道功能异常与肺损害有内在联系，并具有特异性。冯学瑞等[2]通过全结扎大鼠直肠建立第二代肺与大肠相表里实验模型，再次验证了肺损害的特异性，认为与肺泡中吞噬细胞大量死亡有一定关系。韩围栋等[3]改进了冯氏实验模型，制成体外直肠半截扎动物模型，使大肠燥屎内蕴而形成实热郁滞。从肺脏大体解剖、显微结构、超微结构观察肺脏的病理变化。天津南开医院采用连续经口投予大剂量次碳酸铋，使大鼠造成大便秘结，直肠扩张，使模型更接近临床病理过程。

综合以上动物模型的制作及运用效果，首先，模型尽量靠近临床病理过程的便秘症状，其次，动物模型的研究结果使“肺合大肠”理论以直观可视的解剖结构和物质呈现出来。但如果从模型与原形的相似性原则考虑，模型的合理性有待探讨。腑气不通上逆于肺的病理表现在临床中是否指的就是便秘引起的肺气喘逆?根据临床资料显示，很少有看到单纯性便秘引起肺失宣降咳逆喘气之症，在临床中便秘与咳喘往往并见于肺系感染性疾病，便秘模型模拟的只是临床某一疾病发展过程中阶段性的病理表现，鉴于造模方法本身的局限性，往往与所模拟对象有一定的距离，加之如果所模拟对象与临床疾病的本质存在差异，那么这一动物模型的应用价值就有待商榷。

日本学者于1985年首次用葡聚糖硫酸钠(DSS)制备了鼠溃疡性结肠炎(UC)模型，由于此模型的临床症状与病理表现与人UC最相似，至今被广泛用于UC动物实验研究中。DSS是由蔗糖合成的一种硫酸多糖体，最初作为肝素样物质被开发，具有同肝素同样的抗凝血和止血作用。DSS诱发动物溃疡性结肠炎的机理目前尚不清楚，据第一军医大学王群英等报道[4]，DSS致溃疡性结肠炎小鼠模型

较对照组的肠道菌群明显改变，肠道菌群呈明显失调状态。

溃疡性结肠炎又称慢性非特异性溃疡性结肠炎，系原因不明的大肠黏膜的慢性炎症和溃疡性病变，主要累及直肠黏膜、乙状结肠黏膜。其临床上主要表现是腹泻、黏液脓血便、腹痛和里急后重。常见的肠外表现有骨关节病变、皮肤病变、眼病、口腔复发性溃疡等。关于肠外表现发生的机制，目前尚不清楚，可能与自身免疫因素有关，亦可能与溃疡性结肠炎合并细菌感染引起菌血症，或某些有毒物质被吸收，以及治疗药物的副作用有关。正因为溃疡性结肠炎目前发病原因不明确，其肠外表现的发生机制亦不清楚，所以DSS致溃疡性结肠炎小鼠模型临床症状及病理表现与人UC的相似性，为以此模型作为人溃疡性结肠炎模型提供了重要的依据。

临床检测资料显示，本病累及肺部亦非少见，Douglas等[5]对44例炎症性肠病(IBD，克隆病22例，溃疡性结肠炎22例)的肺功能进行评价，结果显示14例有异常改变，9例患者功能残气容积(FRV)与残气容积(RV)升高，这些异常与疾病活动性有关。有人对溃疡性结肠炎患者作肺功能测定，发现有轻度阻塞性通气障碍者占50％，弥散功能降低者占25％。所以，选择溃疡性结肠炎作为模型原型具有临床依据。

溃疡性结肠炎本身机理不明确，被医学界称为“不是癌症的癌症”，属世界性医学难题。选择溃疡性结肠炎作为“肺合大肠”理论实验研究切入点，具有现实意义。

②黏膜免疫指标的选取：人溃疡性结肠炎发病部位主要在直肠黏膜和乙状结肠黏膜，根据黏膜组织的功能之一即对抗原刺激产生应答，黏膜免疫系统各组分共同参与局部免疫，并与整个机体免疫系统存在紧密联系，可建立溃疡性结肠炎与黏膜免疫系统之间的联系，以溃疡性结肠炎为模型，检测黏膜免疫指标具有可行性。黏膜免疫作为肺与大肠共有的解剖生理活动，是联系肺与大肠的重要途径之一，从黏膜免疫角度阐释“肺合大肠”理论具有一定的理论依据。

覆盖在胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道及一些外分泌腺的黏膜面积超过400m2，是病原体进人人体的主要门户。根据功能与分布，可将黏膜免疫系统分成黏膜相关淋巴组织和弥散免疫细胞。黏膜相关淋巴组织主要指分布于胃肠道以及呼吸道的集合淋巴小结，包括小肠的peyer结、支气管相关淋巴组织(balt)及扁桃体等，有上皮细胞覆盖，是黏膜免疫应答的诱导和活化部位；弥散免疫细胞则是黏膜免疫的效应部位。

免疫系统具有感受和对刺激产生应答的作用，免疫系统可识别神经系统不能接受的刺激因子，细菌、病毒、异体蛋白、异体组织细胞以及各种致敏源。黏膜免疫组织对抗原刺激产生应答，系统各组分共同参与局部免疫，并与整个机体免疫系统存在紧密联系。抗原在黏膜表面被抗原递呈细胞摄取、加工、递呈给淋巴细胞是诱导黏膜免疫应答的关键，肠腔抗原被M细胞摄取运送到PP，经抗原提呈细胞加工提呈给T细胞，淋巴滤泡被激活，产生高亲和力记忆型B细胞，致敏T、B细胞经肠系膜淋巴结进入血液，通过血液循环，大部分被带到黏膜固有层，少部分进入其他外分泌组织。

DSS作为一种刺激因子，被抗原递呈细胞摄取、加工、递呈给淋巴细胞，诱导黏膜免疫应答，由于系统各组分共同参与局部免疫，并与整个机体免疫系统存在紧密联系，作用于大肠黏膜的DSS，应该通过免疫系统，在肺的黏膜部位产生相关的效应。当然这一点有待实验证实。

SIgA主要存在于人体呼吸道、消化道及泌尿道分泌液中，具有抑制细菌黏附、凝集抗原的作用[6]。是黏膜免疫最重要的抗体，同样也是从黏膜免疫角度阐释“肺合大肠”理论的重要指标。而且临床发现，溃疡性结肠炎常并发类风湿关节炎、桥本病、结节性红斑等自身免疫性疾病，且肾上腺素类药物或其他免疫抑制剂治疗有一定效果；另外，有学者研究发现在溃疡性结肠炎患者中抗中性粒细胞自身抗体(CNCA)阳性率约60％～85％[6]。说明溃疡性结肠炎与免疫系统功能异常有关。这一点为以溃疡性结肠炎为模型选择黏膜免疫途径阐释“肺合大肠”理论提供实践依据。

4．2实验过程可能存在的问题　本次实验模型组与空白对照组之间的8IgA含量无显著性差异。造成无显著性差异的因素是多方面的，笔者认为可能的因素有：①由于实验器材缺乏，在提取灌洗液时，用一套抽液装置分别抽取两组动物的灌洗液，尽管用生理盐水做了冲洗处理，这一点有可能是影响实验结果的因素之一；②DSS致小鼠溃疡性结肠炎病理发展是一个动态过程，不同时期的黏膜免疫相关指标值处于动态变化中，因而，此次实验结果只能说明DSS致小鼠溃疡性结肠炎第7日这一个时段的两组小鼠的肺泡灌洗液中SIgA含量的变化，不能代表小鼠慢性溃疡性结肠炎黏膜免疫变化的全过程。更不能否定原先的实验设计，即以小鼠溃疡性结肠炎为动物模型，从黏膜免疫角度探讨肺和大肠的相关性，对于模型不同时段的选择，可能是影响实验结果的另一因素；③机体黏膜免疫反应是一个相当复杂的过程，牵扯到众多免疫指标循序的改变，sIgA只是众多免疫成员之一，sIgA是否是最能体现肺合大肠关系的理想指标?尚不能确认，实验结果同样无法否认所选溃疡性结肠炎急性期黏膜免疫角度的肺肠相关性，因而免疫指标的单一化可能是影响实验结果的另一因素。

后续实验应该注意以下几个方面：①动物实验的研究方法要求实验结果以准确数据来体现，因而其实验设计及操作同样要求做到精确无误，尽可能排除一切干扰因素，不但要求具有充分的论证，合理科学的实验设计，更重要的是要有符合要求的实验硬件设备；②对DSS致小鼠溃疡性结肠炎急慢期进行全程观察；③多指标检测可减少单一指标带来的盲目性。

4．3该实验过程的启示　①中医基础理论动物实验研究存在的问题：动物实验研究在中医基础理论研究中扮演了重要的角色，但也存在一定的局限性，表现在以下两个方面，首先，理论与实验要求存在差距。中医基础理论不同予以原子论为主导的以解析分析还原为主要方法所建立的西医理论体系，是以中国古代精气理论为哲学指导，以整体观察与生命体悟并借助类比思维为主要方法建立的理论体系，古代阴阳五行哲学思想在其建构过程中发挥了重要的指导作用。理论本身不但存在很大的歧义性，而且与实验研究所要求的可观察、可检验的特征存在一定差距。以“肺合大肠”理论为例，虽然植根于古代解剖知识、生理、病理现象观察及临床治疗经验，但其最终形成离不开经络理论、阴阳五行哲学思想的整合。其次，动物模型与所模拟对象的差异性。以本实验为例，DSS致溃疡性结肠炎小鼠模型与人体溃疡性结肠炎存在差异性，人体溃疡性结肠炎是一种病因尚不清楚的临床疾病，动物模型是化学物质所致的、局部病理改变类似于人类溃疡性结肠炎的小鼠结肠炎性病变，这种模型动物体内的变化机制还不清楚，该动物模型是否能代表人类溃疡性结肠炎尚无法确定，这一点涉及到动物实验方法作

为人体疾病研究时的价值评价。以上两点也是目前中医理论动物实验研究共同存在的瓶颈。所以，中医基础理论的动物实验研究需要相关研究的理论支撑。

②澄清理论源流：中医学独特的形成发展轨迹形成了其以自然科学知识为主体、与人文社会科学知识相交融的科学知识体系。中医学的学科属性同样体现于中医基础理论的学科特点，以“肺合大肠”理论的形成因素为例，早期形态解剖知识奠定了“肺合大肠”理论的基础；临床生理病理的观察现象是其形成的直接客观因素，有学者认为，中医基础理论“是通过细致而周密的临床观察总结出来的有关脏腑经络的生理学和病理学”[7]；经脉络属关系强化了“肺合大肠”理论的形成；精气、阴阳五行哲学思想从理论的形成方法及结构形式等方面展示了它的影响力。中医理论形成因素的繁杂特征尤其体现在中医基础理论的发生学研究论文中，所以对中医理论澄源清流归门别类有助于中医理论的实验研究。按照认识论原理，知识无外乎分为2类，一是对事物、现象的描述；二是对内在规律的阐发。表现在中医基础理论中，可观察的“象”为实验提供可靠的切入点，而表述内在机理的“理”甚或抽象程度更高的哲学思想为实验所要证实或反驳的“假说”的形成发挥更直接的影响，或本身就可作为“假说”促成实验设计的产生，或给以方法指导，使“假说”的形成有径可循。哲学思想是一种文化的精华所在，而中医基础理论与中国古代哲学思想有着水融的紧密关系，所以加强理论人文科学内涵的研究是实现中医基础理论自主开放发展的前提；而客观分析其自然科学属性，有助于为微观的解剖分析研究搭建桥梁；同时把动物实验研究与临床病症的观察性研究密切结合，作为重要的研究手段，使证实性研究方法具有了创新的潜力。各种研究方法的互补短缺、相得益彰是中医基础理论延续继承并实现主体创新发展的可靠途径。

③选择合适的实验模型：动物实验，属于模型试验，是以动物模型为主要成分的实验形式，它是科学研究中类比法的应用，是实验研究的一种特殊形式。我们知道，类比推理的结论所断定的范围都超过了前提所断定的范围，因为前提所断定的是某个或某类对象的属性，而结论却把这一属性推广到另一个或另一类对象中去，这样的结论显然具有或然性。因此对于类比推理来说，提高结论的可靠性程度就显得尤其重要，要提高其结论的可靠程度，首先要求前提中类比对象间相同或相似属性越多，结论越可靠；第二，前提中类比对象间相同或相似属性与推演属性之间的联系越密切，结论的可靠性程度越高(对于肯定类比推理)。由于中医基础理论内涵的歧异性与实验研究要求的差距，这一逻辑理论对于中医基础理论的实验研究尤其重要。中医基础理论是在特殊的发生背景下，经过特殊的认识方法形成的对人体生命规律的阐述，动物实验的真正目的是我们企图把这些生命规律通过某种动物身体的一些可见物质的变化呈现出来，也就是说，中医基础理论的动物实验是对该理论的另类陈述，即微观类比陈述，为了提高结论的可靠程度，如何加强类比对象问的相似属性成为中医基础理论动物实验研究另一个需要考虑的问题，而从临床某一疾病人手，以此为基础建立动物模型，在一定程度上强化了模型与原型的相似性。

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