消乳块胶囊抑制DMBA诱发大鼠乳腺癌及其机制

摘要：目的：观察消乳块胶囊对二甲基苯蒽(DMBA)诱发SD大鼠乳腺癌的影响及其机制。方法：50天龄splflgue-Dawley系健康雌性禾孕大鼠30只随机分为3组：模型组、治疗组和对照组。模型组和治疗组大鼠均先经两次DMBA(15rag溶于1.5mL芝麻油，间隔1周)灌胃造模，同时治疗组大鼠以消乳块胶囊0.4g/(kg・d)灌胃，持续给药，在第14周处死。大鼠乳腺组织及肿瘤组织均作常规病理，免疫组化检测ERa、ERB、PR、AhR的表达，酶联免疫吸附法测定血浆E2、P、LH、FSH水平。结果：治疗组癌变率明显低于模型组(P

关键词：消乳块胶囊；二甲基苯蒽(DMBA)；乳腺肿瘤；雌激素受体B；芳香烃受体；性激素；垂体激素

中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2009)05-1031-04

消乳块胶囊是浙江大学肿瘤研究所郑树教授根据乳腺良性增生症临床特征和育龄妇女生理特点，以及中医肝郁气滞生乳癖、疏肝理气消乳癖理论设计组成的中西药复方制剂，在治疗乳腺增生、缓解疼痛等方面有较满意的临床疗效。本研究旨在探讨“消乳块胶囊”对9・10－二甲基苯蒽(DMBA)诱导的大鼠乳腺肿瘤的抑制作用及机制，为消乳块胶囊预防大鼠乳腺肿瘤的机制提供初步依据。

1　材料与方法

1.1　动物及分组

50天龄Sprague－Dawley系雌性未孕大鼠30只，平均体重约180g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK(浙2003～0003)实验大鼠置于室温21℃、相对湿度30％～70％、自然光照和基础饲料喂养4天后，随机分为3组：对照组、模型组、治疗组(各10只)。

1.2　实验试剂

9.10－二甲基苯并蒽(DMBA)为SIGMA公司产品，消乳块胶囊系浙江大学医学院附属第二医院制剂室制备，规格为0.4g/粒。PR单克隆抗体(即用型)、AhR单克隆抗体(浓缩型)、ERa单克隆抗体(即用型)和ERβ单克隆抗体(浓缩型)购自福州迈新生物技术有限公司。大鼠孕酮(PROG)、大鼠雌二醇(EStradipl)、大鼠FSH、大鼠LH定量EIA试剂盒，购自上海西唐生物技术有限公司。

1.3　动物给药

剂量设计原则以正常女性(60kg体重)每天处方用量(6粒)的10倍作为大鼠实验用量0.4g/(kg・d)。模型组大鼠分别给予DMBA作乳腺肿瘤造模(每次15mg溶于1.5mL芝麻油中灌胃，间隔1周)；治疗组除同样以DMBA作乳腺肿瘤造模外，给予浓度为0.048s/mL的消乳块胶囊溶液1.5mL灌胃，每天1次，连续给药2周后改每周5次；对照组以1.5mL芝麻油灌胃模拟造模；模型组和对照组均不给予消乳块胶囊，仅以同等体积的CMC溶液同期灌胃。给药第9周根据实际体重调整剂量1次。

1.4　实验方法

第14周时处死大鼠，取乳腺组织及肿块分别置于4％甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色后，光镜下观察。免疫组化采用EnVision二步法。已知阳性片作阳性对照，用TBS液代替一抗阴性对照。具体方法按试剂盒提供的说明书操作。用ELISA法测定血浆E2、P、LH、FSH的含量，具体方法按试剂盒提供的说明书操作。

1.5　结果判定

1.5.1　大鼠乳腺组织学分级　首先由两位资深的病理学专业人员在不了解动物实验分组的情况下，按乳腺组织学分级标准判定大鼠乳腺组织学分级。当两人有分歧时，则参考第3位病理学专家的意见。

1.5.2　免疫组化结果判断ERB、PR阳性染色为细胞核出现棕黄色颗粒，AhR以细胞中细胞浆或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性百分数采用计数估计的半定量判断标准，即每高倍视野(HPF)100个细胞中的阳性细胞数。分级标准如下：无棕黄色表达者为一；阳性细胞率虽不足20％，但局部区域有少量较强着色的阳性细胞者为±；阳性细胞率>20％者依阳性细胞数由少至多、着色由浅至深依次为+、++、+++、++++。并分别计1、2、3、4、5、6分。

1.6　数据处理

各组动物癌变率比较用Fisher确切概率法检验。受体表达和血清激素水平均以均数±标准差(x±s)表示，各组之间的比较采用随机区组设计资料的方差分析。所有数据在SPSS13.0软件包上处理。

2　结果

2.1　实验期间各组动物生长情况

每周定期对各组大鼠称体重，观察动物进食及生长情况，实验期间对照组、模型组、治疗组分别有1只、3只和2只大鼠死亡，大鼠均在早期死亡且未见肿块产生。死因主要为肺部感染、肝脏坏死等，可能与DMBA毒性和灌胃所致的气道阻塞有关。

2.2　大鼠乳腺组织病理学观察

大鼠乳腺组织和肿块镜下观察发现，除对照组外，大多数大鼠有不同程度的增生或癌变发生(见图1)。其中治疗组癌变率为25.0％，与模型组(71.4％)比较有统计学意义(P

2.3　大鼠乳腺组织免疫组化结果

ER13和PR在治疗组和模型组中升高明显，同对照组相比。差异有显著性(P

2.4　鼠血浆激素变化情况

E2、FSH和LH在模型组中升高明显，同对照组和治疗组相比，差异有显著性(P

3　讨论

DMBA作为雌性大鼠乳癌的诱发剂，诱导大鼠乳腺癌形成，由于其组织学类型、对激素的反应性和免疫标记物等方面均与人类乳腺癌有诸多相似之处，因而成为实验性乳癌研究的最佳模型。致癌剂DMBA主要是通过微粒体的羟化酶系经过羟基化、环氧化等代谢过程产生最终致癌

物，某些器官组织在细胞活跃增殖的情况下易受致癌物作用而发生肿瘤。这可能是由于在DNA复制过程中，由于致癌物的干扰产生结构异常的DNA，从而引起细胞恶变，产生组织肿瘤，因而本实验在大鼠出生50天左右给予致癌剂，此时幼鼠乳腺细胞处于增生阶段，DNA合成能力较高，对致癌剂易感性强，易产生肿瘤。对于DMBA诱导大鼠乳腺癌形成的分子特征，文献认为大鼠诱发性乳癌多为激素依赖性，均有ER和PR的阳性表达，由DMBA诱发大鼠乳腺癌中(21天时给药)，到24周观察结果，PR表达水平明显增高(34.2％)，ER的两种亚型ERa和ERβ表达也明显增高，分别为65.8％和70.3％，ERα和ERβ共表达的为51.3％。笔者的实验结果发现ERβ、PR在模型组和治疗组中表达明显增高，同时笔者在实验中还发现了AhR的表达也明显增高，但奇怪的是笔者的实验均未见到ERa的表达。

ERB、AhR和PR在乳腺癌变与增生组织中表达丰富，主要机制可能是AhR介导的AhR－ER交互应答(CROSS－talk)，诱导雌激素信号下游基因的表达。目前多数研究表明，除了遗传背景外，激素与化学因素是乳腺癌发病率持续上升的主要原因，而且，大约3/4的乳腺癌为激素依赖性肿瘤。即使是居住与生活环境的恶化造成的乳腺癌发生增加，乳腺肿瘤组织中仍表达甾体激素受体，并对激素治疗敏感，说明激素与化学因素在乳腺癌发生、发展过程中有协同，研究认为环境致癌物(多数为芳香烃类化合物)通过AhR介导的基因表达是最主要的作用机制，AhR是一个配体激活的核转录因子，许多有机污染物都是它的配体，其作用模式类似于甾体类受体。芳香烃受体核内AhR复合物是由AhR和Amt(AhR nuclear transloctor，AhR核易位子)蛋白组成的异聚体，该异聚体(AhR/Amt)结合到芳香烃受体应答基因(AhR－responsive gene)调节区内的二恶英反应元件(dioxin responsive dements，DREs)，诱导靶细胞表达致癌信号蛋白并发挥作用。此外，还可以通过AhR－ER信号通路之间的交互应答(cross-talk)促进雌激素信号通路的传递，表现为雌激素样作用或雌激素协同作用，使这类致癌物诱发的肿瘤表现为激素依赖性。因此，由于本实验中所使用的致癌剂DMBA也属于多环芳香烃类化合物，结合本实验中大鼠乳腺肿瘤不表达ERα，但PR、ERβ表达明显增加，其中也有AhR表达增加，说明DMBA诱导大鼠产生激素依赖性乳腺肿瘤的机制也可能就是通过AhR介导的AhR-ER交互应答实现的。

笔者的实验结果表明，消乳块胶囊能抑制9，10－二甲基苯蒽(DMBA)诱导的大鼠乳腺肿瘤形成，有较明显的作用。免疫组化检测发现ERβ在治疗组中表达明显增高，结合治疗组癌变率最低，这提示消乳块胶囊对DMBA诱导的大鼠乳腺恶性肿瘤的预防，其机制之一可能是通过ERβ介导的保护作用实现的。有研究发现ERα和ERβ通过雌激素反应元件(ERE)途径参与转录时，其活性一致，但是在非ERE途径与AP1反应时，两者表现出相反的生物学活性。如当通过API位点进行信号传导时，ERα与ERβ介导的雌激素效应完全相反。与ERα结合，17B雌二酵激活转录；与ERβ结合则抑制转录。Lazennec研究发现ERβ能直接抑制MDA MB细胞活动和侵袭，证明ERβ是乳腺癌细胞增殖和侵袭的重要调节剂，并提示ERβ失表达将导致乳腺癌的发生。同时，有研究发现ERα、ERβ与雌激素均有相似的高亲和力，但ERβ与植物性雌激素的亲和力高于ERα。而本研究中消乳块胶囊属中西药复方制剂，而且消乳块胶囊本身虽并非卵巢激素类药物，对小鼠体内激素水平有调节作用。因此，笔者推测消乳块胶囊可能通过ERβ介导的保护作用来抑制大鼠乳腺恶性肿瘤的生成。

消乳块胶囊对大鼠血浆激素变化情况表明，E2、FSH和LH在模型组中升高最为明显，治疗组激素水平略有下降；而P水平在各组之间比较差异均无统计学意义。综合以上分析，通过消乳块胶囊的治疗，可以在一定程度上降低DMBA诱导乳腺癌大鼠血浆E2、FSH、LH水平，这和笔者前期在小鼠上观察到的结果基本一致。目前研究认为，E2可以提高乳腺上皮细胞的增殖率。通过对人类乳腺癌细胞所做的实验，发现雌激素可增强乳腺癌的侵蚀性，可直接或间接促进乳腺癌细胞的增殖。孕激素对乳腺细胞的增殖起促进还是抑制作用，目前还有争论。孕激素在乳腺癌发生中所起的作用，主要是通过调节乳腺细胞的有丝分裂来进行。但是大量的体外实验却得两种完全不一致的结论，即孕激素既有促进乳腺细胞有丝分裂的作用，也有抑制有丝分裂的作用。笔者的实验发现P水平在各组之间变化不大，认为P似乎同DMBA诱导大鼠乳腺癌形成并无关联。

总的来说，实验结果发现消乳块胶囊对DMBA诱导的大鼠乳腺恶性肿瘤有预防作用，其机制可能是通过ERB介导的保护作用和调节体内激素水平来实现。消乳块胶囊除用于治疗乳腺增生、缓解疼痛外，是否可用于乳腺癌的预防有待对其机制及不良反应进一步研究。