当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响

[摘要]目的：探讨当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡和胶原合成的影响。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞，用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性，用流式细胞术分析细胞周期及凋亡，用放射免疫法测定胶原合成。结果：当归水煎液能促进人脐静脉内皮细胞的增殖，且随浓度增大促增殖作用愈大。当归水煎液使S期和G2/M期细胞增多，G0/G1期细胞减少（P

[关键词]当归水煎液；内皮细胞；增殖；凋亡；胶原合成

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0782-03

Effect of angelic decoction on proliferation, apoptosis, collagen synthesis of human umbilical vein endothelial cells

LIU Kai,ZHANG Xuan-fen,ZHANG Jin,QIN Yong-hong,ZHONG Lin

(Plastic Surgery,The Second Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730030,Gansu,China)

Abstract Objective To investigate the effects of angelic decoction on proliferation, cell cycle, apoptosis, and collagen synthesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methods HUVEC was cultured and passaged in Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) and treated with Angelicanaphtha 1mg/L, 4mg/L, and 16mg/L at 1, 3, 5, and 7day respectively. The proliferation was measured with MTT method. The cell cycle and apoptosis were analyzed with Flow cytometry and collagen synthesis was determined with radioimmunoassay. Results The HUVEC proliferation was accelerated by Angelic decoction in concentration-dependent manner (P

Key words:angelic decoction; endothelial cells; proliferation; apoptosis; collagen synthesis

创面愈合和瘢痕形成是新血管形成的结果[1]，内皮细胞增殖和合成细胞外基质是血管形成的基础, 脐静脉内皮细胞是调控血管形成的最佳靶点之一[2-3]。研究表明，当归挥发油对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的增殖呈小剂量刺激、大剂量抑制的双向调节作用，对胶原合成呈抑制效应[4]。然而，当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡和胶原合成的影响未见报道。我们的研究旨在探讨当归水煎液对创面愈合和瘢痕形成的作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 主要试剂：高糖DMEM细胞培养基(Gibco公司) ，胎牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司) ，胰蛋白酶（Amresco公司），EDTA（西安化学试剂厂），吐温-80(上海大众制药厂，批号:700934) ，MTT(华美生物技术公司) ，二甲基亚砜（北京亚太精细化工公司），碘化丙啶（Sigma公司），兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体(Santa Cruz公司 ），Ⅲ型前胶原氨端肽(Procollagen Ⅲ N-terminal peptide，PⅢNP）放射免疫分析试剂盒(北方生物技术研究所) 。

1.1.2仪器：Olympus倒置相差显微镜(日本Olympis公司)，Olympus万能倒置相差显微镜(日本Olympis公司)，Olympus显微镜(日本Olympis公司)，层流超净工作台（苏州净化设备厂），SHEL.2300 CO2恒温孵育箱(日本Sanyo公司)， 流式细胞仪(美国BD公司，FACScan)，Wellscan MK2型酶标仪(英国Labsystems dragon)，Sanyo冰箱（日本Sanyo公司），TJL-16B型离心机（上海静安亭科学仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及鉴定：细胞培养参照Jaffe[5]方法。取人新鲜脐带，采用胶原酶脐静脉灌流消化法分离HUVEC，接种于含有20%胎牛血清(FBS)、青霉素105 U/l、链霉素100mg/L的DMEM液，37℃5%CO2饱和湿度培养。细胞融合后，用胰蛋白酶消化传代，实验选用第3～5代细胞。台盼蓝染色细胞活性在95%以上，经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定阳性[6-7]，倒置显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列，证实所培养细胞为内皮细胞。

1.2.2 药物制备及分组：当归购自甘肃岷县，经兰州大学生药教研室马志刚教授鉴定确认为伞形科植物当归的根。当归水煎煮3次，并浓缩至含生药1g/ml。0 22μｍ微孔滤膜过滤除菌,4℃保存备用。实验最大浓度为24h细胞半数致死量的1/4。实验分4组：用DMEM配成终浓度为100mg/L、400mg/L、1 600mg/L的当归水煎液，对照组用DMEM培养液。

1.2.3 细胞生长曲线测定：取对数生长期的血管内皮细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔培养板中，常规培养24h后，按分组给药。分别于孵育1、3、5、7天后常规消化细胞，于低倍镜下计数细胞，然后计算每毫升细胞数三次，取平均值。绘制细胞生长曲线。

1.2.4 细胞增殖检测：用噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)染色法检测细胞增殖。内皮细胞悬液（1×105个/ml）接种于96孔培养板，80%DMEM+20%FBS的培养液37℃ 5%CO2饱和湿度培养24h后，按分组给药，继续培养48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，弃去培养液，加入DMSO 150μl/孔，振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪上490nm波长下测各孔光吸收值(OD)，每组8复孔。试验重复2次。按下列公式计算促增殖率：促增殖率＝（当归组OD值－对照组OD值）（对照组OD值－培养液组OD值）×100%。

1.2.5 细胞周期及凋亡检测：用流式细胞术（Flow cytometry, FCM）检测细胞周期及凋亡。取对数生长期的内皮细胞，不含胎牛血清的DMEM培养24h后，分别加入不同浓度当归水煎液的DMEM培养48h。对照组加等体积的DMEM。常规消化离心细胞，PBS洗3次，以预冷的70%乙醇4℃固定过夜，RNA酶37℃消化30min，碘化丙啶(PI)染色后上流式细胞仪检测各组细胞中DNA，每个样品至少测定10 000个细胞以上。试验重复2次。

1.2.6 胶原合成测定：用放射免疫法测定培养上清液中的Ⅲ型前胶原。取融合生长良好的内皮细胞，不含胎牛血清的DMEM培养24h后，分别加入不同浓度当归水煎液的DMEM培养48h。对照组加等体积的DMEM。分别于12h、24h、48h后吸取培养上清液，-20℃保存，2周内检测。

采用Ⅲ型前胶原氨端肽(PⅢNP）放射免疫分析盒检测Ⅲ型胶原纤维的合成。检测时，于1.5ml离心管中加入上清液100μl和兔PⅢNP抗体200μl，4℃放置20h，加125I-PⅢNP100μl，充分摇匀4℃放置4h，加驴抗兔免疫分离剂500μl，充分摇匀，室温放置20min，4000r/min离心30min，吸弃上清液，在γ计数器测定各个沉淀管的放射活性。重复测定2次，取平均值。

1.2.7 统计学处理：计量资料以均数±标准差表示。用单因素方差分析比较组间差异显著性。应用SPSS10.0 软件包处理。P

2 结果

2.1 不同浓度的当归水煎液对HUVEC生长的影响：随着培养时间延长，各组均显示出不同程度的促生长效应。1 600mg/L的当归水煎液促生长效应最明显，见图1。

2.2 不同浓度的当归水煎液对HUVEC增殖的影响：各组均有促增殖作用，随着浓度增大促增殖效果愈加明显，见表1。

2.3 不同浓度的当归水煎液对HUVEC周期和凋亡的影响：给予不同浓度的当归水煎液干预后，HUVEC周期各时相的细胞数占细胞总数的百分比与对照组比较有明显的不同，S 期和G2/M期细胞增多， G0/G1期细胞减少，提示当归水煎液浓度增大可促进内皮细胞DNA的合成，加快细胞增殖（P

2.4 不同浓度的当归水煎液对HUVEC胶原合成影响：随当归水煎液浓度增加和作用时间延长，当归水煎液对HUVEC培养上清液PⅢNP的浓度呈抑制作用（P

3 讨论

创伤愈合过程中血管内皮细胞具有重要作用。创伤后形成的肉芽组织的主要成分是成纤维细胞和毛细血管，新生的毛细血管则是由邻近毛细血管内皮细胞分裂增生演变而来。血管内皮细胞功能与血管内皮生长因子（VEGF）密切相关，VEGF是一种强效的血管生成促进因子，具有强烈的促进内皮细胞增殖作用，能增加细胞外基质合成和促进血管生成。当归促进HUVEC增殖，其机理可能是促进内皮细胞上VEGF的高表达[8]、增加内皮细胞周期中的S期和G2/M期而发挥作用。

中药当归为伞形科植物当归的根，有活血化瘀、软坚散结等功效。当归活性成分分为挥发油和水溶性两大部分，挥发油主要为抑制性成分，水溶性部分为兴奋性成分[9-11]。王保华[12]报道当归水煎液及其主要成分阿魏酸钠能促进内皮细胞增殖。我们的实验验证了上述观点，并发现当归水煎液促进内皮细胞增殖随浓度的增大而增强。

我们发现当归水煎液可剂量依赖性及时间依从性地抑制HUVEC合成胶原。有实验表明当归注射液能拮抗大鼠气管内注入博莱霉素诱导的肺纤维化[13]，可显著降低四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型的血清Ⅲ型前胶原水平[14]，可抑制成纤维细胞合成胶原[15]。这些结果均支持当归水煎液可用于防治增生性瘢痕。当归水煎液抑制HUVEC胶原合成的机制可能以下两个方面：①可能与其能有效抑制胶原蛋白交联、透明质酸解聚和脂质过氧化[16]；②通过降低TGFβ1表达来抑制胶原合成[17]。

本次实验以人HUVEC为靶细胞，证明当归水煎液可以促进HUVECB的增殖、抑制细胞凋亡及胶原合成从而发挥抗纤维化的作用。为当归治疗增生性瘢痕（HS）提供了实验基础。

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-03-09