浅说VP2基因的克隆技术

1材料与方法

病毒阳性病料从临床患病猪的血清和肺脏中取样，由本实验室鉴定并保存。主要试剂及质粒DNA提取和质粒抽提试剂盒均购自天泽基因工程有限公司(北京);IPTG、Taq酶、dNTP、pMD18-T载体克隆试剂盒、T4DNAligase、各限制性内切酶均为TaKaRa公司产品;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;蛋白质Maker购自Fermentas公司;蛋白纯化镍柱购自公司;抗组氨酸抗体购自Sigma公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体、ECL显影试剂盒购自碧云天生物技术研究所;原核表达质粒pET32a(+)及大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本实验室保存。引物设计根据GenBank中收录的猪博卡病毒基因组序列比对结果(登录号为GU902967-GU902971)，利用DNAStar和Primer5．0软件设计了用于扩增猪博卡病毒VP2基因的特异性引物，在上游引物中引入BamHⅠ限制性内切酶位点，在下游引物中引入XhoI限制性内切酶位点，预计扩增片段为795bp。引物序列为:上游引物;下游引物下划线表示酶切位点)。引物由大连宝生物工程有限公司合成。病毒DNA提取及PCR扩增取100mg阳性组织病料，加入1mlPBS缓冲液进行充分研磨，－20℃反复冻融3次，8000r/min离心10min，取上清液200μl，或取血清200μl进行病毒DNA抽提，提取方法参照病毒DNA提取试剂盒说明书。以提取的DNA样品为模板，扩增体系为，模板DNA2.00μl，上、下游引物各1.00μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，用灭菌蒸馏水补充至50.00μl体系。反应条件为:94℃预变性个循环;72℃延伸10min。原核表达质粒的构建及鉴定按DNA胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别酶切回收的PCR产物和pET32a(+)质粒，切胶回收相应片段后，用T4DNA连接酶于16℃水浴连接过夜。将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，振荡培养，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选出阳性质粒，送大连宝生物工程有限公司测序。重组质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE分析将获得的阳性重组质粒(宿主菌BL21)按1%接种LB液体培养基(含氨苄青霉素)中，于37℃振荡培养至OD600为0．5～0.7时，加入IPTG至终浓度为100mmol/L，诱导表达目的蛋白，并分别在培养3h和5h时取1ml菌液，同时收集未诱导的菌液作为阴性对照，对经转化BL21的空载体也以相同的条件诱导，作为对照。用12%的SDS-PAGE检测重组蛋白。重组蛋白表达产物的纯化诱导表达50ml重组菌，收集菌液，超声裂解后，12000r/min离心20min后收集上清液，用镍柱对融合蛋白进行亲和纯化，将纯化后的融合蛋白进行12%SDS-PAGE电泳分析。重组蛋白的Westernblot鉴定对诱导5h的重组菌进行Westernblot检测鉴定。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭，以抗组氨酸抗体为一抗，HRP酶标羊抗鼠IgG抗体为二抗，加入ECL底物显色液，室温作用5～10min至显色充分，用双蒸水终止反应，拍片观察并保存。

2结果

对PCR产物回收后进行连接、转化，对重组质粒pET32a-VP2用BamHⅠ和XhoI进行酶切鉴定，结果显示，除载体片段外，还出现了795bp的条带，其大小与预期结果一致。测序结果表明VP2序列与Gen-Bank中猪博卡病毒的VP2基因序列完全相同，表明重组质粒构建正确。(DE3)中经IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳分析发现，与空载体pET32a(+)的菌液相比，重组质粒的诱导菌在大小49000处出现一条较粗的蛋白条带，大小与融合蛋白的理论值一致，随着诱导时间的增加，其表达量也随之增加。而未诱导的重组质粒转化菌和空载体质粒转化菌均没有出现相同的条带。扩大培养后，收集细菌，经超声破碎及离心分离沉淀和上清，分别进行SDS-PAGE，结果显示重组蛋白主要存在于上清中，表明蛋白表达产物以可溶性形式存在为主。进一步利用镍柱对其纯化，得到一条大小49000的清晰条带，与预期相符重组蛋白的表达、鉴定与纯化重组表达质粒pET32a-VP2在大肠杆菌BL212．

3表达产物的Westernblot检测

建立一种快速、敏感、简便的血清学检测方法成为当务之急。本研究构建了重组质粒pET32a-VP2，并在大肠杆菌中成功表达了猪博卡病毒的VP2蛋白。结果表明，经IPTG诱导后，重组蛋白有很高的表达量，且以可溶性蛋白形式存在;经过柱纯化后，该蛋白纯度较高;经Westernblot鉴定，证明该蛋白具有很x好的反应原性。目前研究结果都表明VP2蛋白可作为诊断抗原的候选蛋白。因此，本研究为进一步深入研究猪博卡病毒VP2蛋白的结构与功能奠定了基础，同时为建立血清学诊断方法，如间接ELISA方法和胶体金免疫层析试纸条等提供了候选蛋白。

作者：李彬杜露平何孔旺单位：江苏省农业科学院