三七总皂苷对糖尿病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的影响

摘 要：目的：观察三七总皂苷对糖尿病大鼠肾脏CTGFmRNA表达的影响及其对肾脏的保护作用，以探讨三七总皂苷防治DN的可能作用机制。方法：用STZ诱导大鼠DM模型，并将成模大鼠随机分为糖尿病模型组（DM组），三七总皂苷组（PNS组）和氨基胍组（AG组），同时建立正常对照组（NC组）。PNS组给予三七总皂苷100mg•kg1•d1灌胃，AG组给予氨基胍100mg•kg1•d1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1mL•100g1•d1灌胃，共8周。观察各组大鼠的血糖，24h尿蛋白定量，肾脏肥大指数及肾小球体积的变化，肾脏CTGFmRNA表达的变化。结果：①SD大鼠用STZ造模后，血糖明显升高（P＜0.01），而PNS组、AG组及DM组比较血糖无显著差异（P＞0.05）。②DN组24ｈ尿蛋白定量与NC组相比有明显增高（P＜0.01），PNS组、AG组与DN组比较，24ｈ尿蛋白定量减少（P＜0.01），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。③DM组与NC组比较，肾重／体重明显增加（P＜0.01），PNS组、AG组与DN比较，肾重／体重显著降低（P＜0.01），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。DM组大鼠的MGA与MGV均较NC组增大（P＜0.05）；PNS组、AG组的MGA、MGV则较DM组小（P＜0.05），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。④与NC组比较，DM组大鼠肾脏CTGFmRNA表达明显增高（P＜0.01），PNS组、AG组大鼠肾脏CTGFmRNA表达较DM组降低（P＜0.05），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。结论：三七总皂苷具有降低糖尿病大鼠尿蛋白，减轻糖尿病大鼠肾脏肥大，下调肾脏结缔组织生长因子表达的作用，与西药氨基胍相比无明显差异。

关键词：三七总皂苷；糖尿病肾病；结缔组织生长因子

中图分类号：R285.5文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-1042-04

Effects of PNS on CT GF in Diabetic Rats

FU Zhenchun1,XU Gang1,GE Tingai2,JIANG Tingting2,YUAN Chiting2

（1.Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University College,Hangzhou 310015,Zhejiang,China；

2.Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,Zhejiang,China）

Abstract：Objective:To observe the effects of PNS on CTGF in Diabetic rats and protection on kidney,and explore its possible functional mechanism. Method：Diabetic rats were induced by STZ, divided into DM group, PNS group,and AG group randomly, And normal control group were divided into simultaneously. PNS group were intragastric administered with PNS at 100mL•kg1•d1, AG group were administered with AG at 100mg•kg-1•d-1, normal control group and DM group were administered with isotonic Na chloride at 1mL•100g-1•d-1.The administration duration was 8 weeks. At each group of rats, the following items were measured: blood glucose, kidney weight/ body weight, urinary protein amount in 24h, renal hypertrophy index number, glomcrulus volume, the variation of GF.Results: ① Blood glucose of STZ-induced diabetic rats increased obviously(P＜0.01),There’s no marked difference on blood glucose among PNS，AG，DM groups (P>0.05).② The 24h urinary protein quantity was much heightened in DM groups compared to NC group(P0.05).③The kidney weight was reduced in DM group compared to NC group(P0.05).MGA and MGV were increasing in DM group compared to NC group(P

Keywords:Panax pseudo-ginseng total glycosides；diabetic nephropathy；connective tissue growth factor

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见而严重的并发症，是导致终末期肾病的常见原因。DN的基本病理改变为肾脏肥大、肾小球基底膜增厚和系膜基质进行性积聚，最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化。其发病机制尚未完全明了，其中细胞因子、生长因子和肾素-血管紧张素系统起着重要作用。研究证明结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表达增高对DN的进程有重要影响，降低CTGF的表达对DN的防治具有重要意义。临床研究表明中药三七对DN有着良好的疗效，本实验拟通过观察三七总皂苷对糖尿病大鼠肾脏CTGF基因表达的影响和对肾脏的保护作用，以探讨三七总皂苷防治DN的可能作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

清洁级3月龄SD大鼠35只，雄性，体重150～200g，浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室，室温21～25℃。1.2试剂

链脲佐菌素（STZ）、氨基胍（AG）为美国Sigma公司产品，血栓通胶囊（每粒含三七总皂苷100mg）为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品。血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供，尿蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供；总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。DNA梯度 Marker由Takara公司提供。

1.3引物

搜索GenBank数据库大鼠CTGF mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计CTGF及内参GAPDH引物，委托上海生工生物工程公司合成，序列如下：CTGF引物：上游：5’-GGCCCTGCCCTAGCTGCCTA-3’，下游：5’-TGGAGATGCCCATCCCACAG-3’，目标长度：130bp；GAPDH引物：上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’，下游：5’-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’，目标长度：276bp。

1.4方法与步骤

1.4.1造模 分组及治疗 适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组，6只)和糖尿病造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2%的溶液，放于冰浴中。造模大鼠禁食不禁水14h，将STZ以65mg/kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模，2h后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后连续3天尾静脉检测血糖（Glucose Glu）。以连续3次血糖>16.65mmol/L，尿量>原尿量150%，饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准[1-2]。造模后选取符合成模标准，状态稳定的糖尿病大鼠(共24只)，随机分为糖尿病模型组（DM组，8只），三七总皂苷组（PNS组，8只）和氨基胍组（AG组，8只，在实验过程中死掉1只），并予药物进行干预。其中，PNS组给予三七总皂苷100mg•kg1•d1灌胃，AG组给予氨基胍100mg•kg1•d1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1mL•100g1•d1灌胃。共8周。

1.4.2标本收集与处理 第8周末于处死大鼠前1天，用代谢笼收集24h尿标本，记录尿量后取5mL保存于-20℃冰箱中待测；大鼠称重后，从股静脉采血，分离血清待测；随后处死大鼠，取双肾，去掉肾包膜称重，右肾用10%中尔马林溶液固定，行PAS染色，左肾液氮冷冻，-70℃冰箱冻存，用于提取总RNA。

1.4.3指标检测采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖，用考马斯亮兰法检测尿蛋白，并计算24h尿蛋白定量。

1.4.4肾组织病理学检查 取适量右肾组织行石蜡包埋，制成厚度为3μm切片，行PAS染色，光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用多功能彩色病理图像分析系统在200倍下进行病理分析。每个切片随机选择10个正切的肾小球，测定肾小球平均截面积（MeanGlomerular Area, MGA），取其平均值作为每个标本的MGA，并根据公式肾小球平均体积（Mean Glomerular Volume, MGV）=1.25×（MGA）3/2计算MGV。

1.4.5肾皮质CTGFmRNA的检测 分别取各组大鼠肾皮质100mg，按Trizol试剂说明书操作，提取总RNA。所得RNA，用紫外分光光度计测260nm/280nm处的紫外吸收值（OD值），每个样品重复测3次，结果：所提取的RNAA260/280比值约在1.8～2.0。将所提取的总RNA经1％的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带，证实RNA无降解。

取3μLRNA样品，1μL Oligo(dT)18加入一无RNA酶的200μL薄壁PCR管中，用灭活DEPC水补足至10μL，混匀。65℃加热变性10min，迅速冰水浴0.5min，37℃3 min。按下列顺序加入：5×Buffer 4μL，dNTP(10mM)1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，M-MLV逆转录酶(200U/μL)0.8μL，DEPC水最终补足至20μL混匀，42℃反应1h，然后95℃10min以灭活逆转录酶，短暂离心，-20℃冻存。

取上述逆转录反应产物10μL行PCR，按下列步骤操作(30μL反应体系):cDNA10μL，10×Buffer2.5μL，MgCl2(25Mm)2μL，dNTP（10mM）0.5μL，CTGF引物正、负引物各0.5μL，DEPC-H2O 13.8μL，Taq DNA酶0.2μL，将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，进行30个循环扩增，最后72℃延伸5min。PCR产物-20℃冻存。

GAPDH的PCR扩增按下列步骤操作(30μL反应体系):cDNA3μL，10×Buffer3μL，MgCl2(25Mm)1.8μL，dNTP（10mM）0.6μL，GAPDH引物正、负引物各0.5μL，DEPC- H2O 20.1μL，TaqDNA酶0.5μL，将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，进行30个循环扩增，最后72℃延伸5min。PCR产物-20℃冻存。

取8μL PCR产物与2μL上样液混合，以2%琼脂糖（含溴化乙锭 0.5g/mL），在1×TAE缓冲液中，电压80V的条件下电泳，电泳结果在紫外灯下观察，以GAPDH为内参照，用凝胶扫描成像系统对产物进行半定量分析，结果以CTGF与对应的GAPDH密度积分比值表示CTGFmRNA相对表达量。

1.4.6统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示，样本均数组间的比较用One-WayANOVA(单因素方差分析)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane's T2检验。P

2结 果

2.1各组大鼠体重血糖24h尿蛋白定量的比较

DM大鼠均出现明显多饮、多食、多尿、消瘦等症状。与NC组比较，DM组、PNS组、AG组体重明显偏轻（P＜0.01），而PNS组、AG组及DM组比较体重无显著差异（P＞0.05）；与NC组比较，DM组、PNS组、AG组血糖明显升高（P＜0.01），而PNS组、AG组及DM组比较血糖无显著差异（P＞0.05）；DN组24ｈ尿蛋白定量与NC组相比有明显增高（P＜0.01），PNS组、AG组与DN组比较，24ｈ尿蛋白定量减少（P＜0.01），PNS组、AG组与NC组相比，24ｈ尿蛋白定量无统计学差异（P＞0.05），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。

提示SD大鼠用STZ造模后，可形成大鼠糖尿病模型。PNS与AG均不能延缓糖尿病大鼠消瘦的进程，均不能降低糖尿病大鼠的血糖，糖尿病大鼠在持续高血糖状态8周后，24ｈ尿蛋白定量较正常大鼠升高，PNS与AG能减少糖尿病大鼠24ｈ尿蛋白定量至正常水平，其作用效果相似。如表1。

2.2各组大鼠肾脏肥大指数平均肾小球面积与平均肾小球体积的比较

大鼠肾脏肥大指数可用肾重／体重来表示，DM组与NC组比较，肾重／体重明显增加（P＜0.01），PNS组、AG组与DN比较，肾重／体重显著降低（P＜0.01），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。DM组大鼠的MGA与MGV均较NC组增大（P＜0.05）；PNS组、AG组的MGA、MGV则较DM组小（P＜0.05），而与NC组比较无统计学差异（P＞0.05），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。如表2。

提示PNS与AG能减少糖尿病大鼠的肾脏肥大指数，改善糖尿病导致的DN早期肾小球体积增大，两者作用效果相似。

2.3各组大鼠肾皮质CTGFmRNA的比较

与NC组比较，DM组大鼠肾脏CTGFmRNA表达明显增高（P＜0.01），PNS组、AG组大鼠肾脏CTGFmRNA表达较DM组降低（P＜0.05），PNS组与AG组比较差异不明显（P＞0.05）。

3讨 论

研究表明[3－6]，无论是2型糖尿病还是1型糖尿病，其早期的肾脏损害无本质差异，均为肾脏肥大，并证实肾脏肥大是预示后期肾功能减退的一个形态学指标。目前较一致的看法是，糖尿病所导致的肾脏肥大是由于糖代谢紊乱及其所导致的血流动力学、细胞因子等多种因素综合作用的结果。既往许多研究已揭示高糖、AGEs、AngII、TGF-β等与糖尿病肾脏肥大形成可能有关，而近来发现上述因素均可以刺激肾脏细胞产生纤维化因子―结缔组织生长因子(CTGF)，并通过CTGF进一步介导肾脏损害。CTGF是Bradham等[7]于1991年首次在人的脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的细胞因子。它属于一种即刻早期基因CCN家族成员之一，广泛存在于人类多种组织器官，如心脏、肺脏、肝脏、肾脏和结缔组织中，尤其在肾脏中含量最高。生理状态下，CTGFmRNA在肾小球壁层、脏层上皮细胞，肾间质成纤维细胞和管周毛细血管内皮细胞中仅有少量表达[8]。在一些病理状态下，特别是在伴有细胞增生和ECM合成的肾小球系膜和小管间质病变区，CTGF表达量明显增加[9－11]。而在微小变性肾病综合征、特发性膜性肾病和急性链球菌感染后肾小球肾炎中，CTGFmRNA含量正常或仅轻度升高。显示CTGF的表达与肾脏的增生性或纤维化性病变密切相关，糖尿病肾病肾脏病理改变属于典型的增生性改变。小鼠DN早期，即使仅有轻度系膜增生，无蛋白尿和间质病变时，就可检测到系膜区CTGFmRNA明显增加，而肾脏中其它部位无明显改变[12]。刘必成等[13]研究发现在STZ诱导的糖尿病大鼠早期肾小球肥大的同时，肾小球CTGF表达明显增加，而且CTGF的表达与肾小球体积、24h尿蛋白定量有显著的相关关系。本实验研究亦证实糖尿病大鼠24h尿蛋白定量、肾脏肥大指数及肾小球体积均与正常对照组增高，有显著性的差别，其CTGFmRNA的表达比正常对照组也明显升高。近期的临床研究证实，尿和血CTGF浓度与DN的严重程度(尿白蛋白排泄量)[14-16]和肾小球滤过率[16]呈正比，尿或血中CTGF含量被认为是DN的预测因子。故特异性阻断CTGF的表达与合成将为临床防治包括DN在内的肾纤维化提供新的治疗途径,从而延缓DN的病程进展。

目前，瘀血贯穿糖尿病肾病的始终已成为中医医家的共识。瘀血既是病理产物，同时又是导致疾病加重的致病因素。糖尿病肾病的瘀血证特点及应用活血化瘀法防治糖尿病肾病得到了广泛的研究。沈庆法[17]认为即使在症、舌、脉上可能无明显的瘀证表现，在肾小球硬化和肾间质纤维化过程中，血流动力学的改变、免疫反应介导的凝血机制的紊乱、肾脏病理学的改变(如细胞外基质的积聚、细胞的增殖、纤维蛋白样物的沉积、血栓形成、血管襻闭塞、局灶或节段性肾小球硬化与间质纤维化等)都是“内结为血瘀”的表现。DN早期肾脏肥大，肾小球细胞外基质（ECM）过度积聚，以及DN所表现的肾小球硬化与间质纤维化等都可作为DN应用活血化瘀法的指征。近年来对活血化瘀类中药防治肾脏纤维化的现代药理研究发现，活血化瘀类中药主要通过抑制MCs的异常增殖、细胞外基质的过度积聚、调控肾脏固有细胞凋亡、调节血管活性物质、影响细胞因子的表达、调节基质降解酶等多种途径发挥其防治肾脏纤维化的作用。CTGF被认为是介导TGF-β促纤维化活性的下游效应因子，在刺激细胞增生、ECM合成及促进组织器官纤维化方面起着重要作用[18]。因此，在用活血化瘀研究防治DN的过程中，有必要对化瘀中药对于机体内CTGF的表达调节进行深入的研究。血塞通颗粒的主要成份为三七总皂苷（PNS），PNS是中药三七的有效成份,在肾脏内分布浓度很高,具有抗炎活血化瘀的作用,临床研究表明能显著降低糖尿病肾病患者的尿蛋白[19-20]。本实验研究发现，PNS及AG能显著降低糖尿病大鼠的肾皮质CTGFmRNA的表达，改善糖尿病大鼠肾脏肥大程度，减少24h尿蛋白定量，对糖尿病大鼠肾脏起着保护作用。但同时本实验也发现，PNS及AG不能明显下调糖尿病大鼠的血糖，提示PNS与AG对糖尿病大鼠肾脏的保护作用不是通过控制大鼠的血糖来完成的。本实验显示PNS及AG均能下调肾皮质CTGFmRNA的表达，推测PNS与AG对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与此有关。最近证实，AG作为糖基化终产物（AGEs）的阻制剂，可通过抑制AGEs形成及阻止AGEs与受体的相互作用而减少CTGF表达[21]，延缓DN进展。但AG对人体具有较大的副作用，目前尚处于实验研究阶段。虽然PNS对CTGF的上游因子的作用机制尚有待进一步的研究，三七作为活血化瘀类的经典药物，其在动物实验及临床实验中所显示的对DN良好的防治效果，为活血化瘀中药及其提取物应用于临床防治DN提供了一定的理论依据。

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