齐墩果酸联合他克莫司对肾移植大鼠Th1/Th2细胞的影响

【摘要】 目的：观察齐墩果酸（OA）联合他克莫司（FK506）对肾移植大鼠1型和2型辅助T（Th1/Th2）细胞的影响，探讨将OA应用于肾移植领域的价值。方法：以BN大鼠为供体，LEW大鼠为受体，建立大鼠同种异体肾移植模型。将48只受体大鼠按照随机数字表法均分为对照组、OA组、FK506组、OA+FK506组，术前1 d开始进行药物干预。记录每组6只大鼠存活时间，并监测其血清肌酐浓度。每组的另外6只大鼠则在术后第5天，用多功能流式点阵仪（Luminex）检测Th1细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）以及Th2细胞分泌的白介素- 4（IL-4）、白介素-6（IL-6）的血清浓度；酶联免疫斑点法（ELISpot）检测表达IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6的T细胞频率。结果：与其他各组比较，OA+FK506组的移植肾存活时间显著延长。与对照组比较，FK506组和OA+FK506组的血清IL-2的浓度显著降低，而OA+FK506组的降低更明显；各药物处理组血清IFN-γ、IL-4、IL-6的浓度显著降低，而OA+FK506组的降低更明显；表达IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6的T细胞频率明显下降，而OA+FK506组的下降更明显。结论：OA能协同FK506抑制Th1/Th2细胞，减轻排斥反应，最终促进大鼠移植肾存活。在临床肾移植领域，OA具有协同FK506促进移植肾存活的潜力。

【关键词】 齐墩果酸； 他克莫司； 肾移植； 辅助T细胞； 细胞因子

中图分类号 R392.4 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2014）16-0001-03

当今器官移植仍处于免疫抑制剂时代，对排斥反应有效的抑制是移植成败的关键。他克莫司（tacrolimus，FK506）是免疫抑制方案中的基础用药，它通过抑制钙调神经蛋白酶，下调下游产物核因子-κB（NF-κB），使IL-2等细胞因子表达减少，从而达到较强的免疫抑制效果。虽然FK506的免疫抑制作用很强，但它仍可引发多种副作用，如移植术后糖尿病（PTDM）、感染等，而其肾毒性招致的移植肾肾病是最令人无奈且不可避免的副作用[1]。这些副作用损害了移植肾功能，缩短了移植肾存活时间。很多器官移植中心采用以低剂量FK506为基础的免疫抑制方案，以减少FK506的副作用，但引发了较多的因排斥反应导致移植肾失功的不良事件。因此，找到能协同FK506进行免疫抑制治疗的药物，以期减少FK506的用量、达到减轻其副作用的目的成为器官移植界迫切需要。

有研究表明，齐墩果酸（oleanolic acid，OA）具有明确的抗氧化、抗感染作用[2]。然而，OA是否能协同FK506通过抑制Th1/Th2细胞、最终促进移植肾存活，尚未见报道。本实验通过建立大鼠肾移植模型，观察OA联合FK506对肾移植大鼠Th1/Th2细胞数量和功能的影响，探讨将OA应用于肾移植领域的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

12周龄近交系Brown Norway（BN， RT1n）和Lewis（LEW， RT11）雄性大鼠（批号：SCXK京20010-0012），每只体重200～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 手术器械与相关药品

显微外科手术器械（上海手术器械厂）、手术显微镜（镇江中天光学仪器厂，型号：XTS）、11-0棉纶带线、缝合针（上海医用缝合针厂）、HCA肾保存液（上海长征医院）、生理盐水、无菌冰、青霉素、10%盐酸氯胺酮注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司）、硫酸阿托品、甲磺酸酚妥拉明注射液、肝素钠注射液、利多卡因注射液等。

1.3 大鼠肾移植模型的建立

本文在Lee[3]的基础上适当改良，采用显微外科技术，以BN大鼠为供体，LEW大鼠作为受体。供体大鼠行左侧肾脏摘除，受体大鼠行左侧肾脏原位移植，受体大鼠对侧肾脏血管结扎（代替肾切除）。术后将受体和供体大鼠置于加热垫上复温，苏醒后喂5%葡萄糖生理盐水，恢复行走后放入鼠笼，正常喂养，定时观察，防止术后尿潴留和感染等并发症。

1.4 分组与给药

按随机数字表法分为4组，每组大鼠12只：（1）对照组（DMSO-PBS溶液）；（2）OA组（OA， 25 mg/kg）；（3）FK506组（FK506， 10 mg/kg）；（4）OA+FK506组（FK506， 10 mg/kg；OA， 25 mg/kg）。OA原液购于广东南国药业有限公司，FK506原液购于诺华公司。OA原液溶解于DMSO（二甲基亚砜），FK506溶解于PBS（磷酸盐缓冲溶液）。从术前1 d开始，在各组大鼠腹腔内注射相应药物，1次/d。从每组随机选取6只大鼠用作检测肾功能和记录存活时间，另外6只大鼠则用作Luminex和ELISpot检测。

1.5 移植肾存活时间和血清肌酐的检测

监测大鼠存活情况，记录大鼠存活时间（即移植肾存活时间）。术前1 h检测血清肌酐1次，术后检测血清肌酐，2 d/次，抽取活大鼠尾静脉血0.5 ml送检。

1.6 Luminex（多功能流式点阵仪）检测血清细胞因子

处死肾移植大鼠，抽取下腔静脉血2 ml，用多重微珠免疫分析试剂盒（Biosource International Inc）检测大鼠血清中的干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）的浓度。严格按试剂盒说明书由专人进行操作。

1.7 ELISpot（酶联免疫斑点法）检测表达IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的T细胞频率

处死供受体大鼠，取大鼠脾脏，用荧光标记的供体脾脏细胞刺激受体脾脏细胞，用ELISpot（酶联免疫斑点法）对表达IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的受体脾脏T细胞进行计数[4]。将浓度为5 μg/ml的捕获单克隆抗体（美国BD-Biosciences Pharmingen公司）涂覆在多微孔滤板（ 美国Millipore公司）过夜后，将3×105个受体脾细胞均分为3份，按1∶1的比例与供体脾细胞在多微孔滤板培养。48～72 h后，加入二抗（Abs），后加入链酶亲和素孵化，用酶联免疫斑点分析仪成像并进行软件分析。

1.8 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用字2检验，P

2 结果

2.1 移植肾功能

如图1所示，对照组的血清肌酐水平上升急速，OA组血清肌酐水平上升比对照组慢，但比FK506组和OA+FK506组上升明显快；FK506组、OA+FK506组的血清肌酐水平上升缓慢，而FK506组的血清肌酐水平上升比OA+FK506组快。

2.2 移植肾存活时间

如图2所示，对照组移植肾存活时间为（5±1）d，OA组为（9±2）d，FK506组为（16±3）d，OA+FK506组为（26±3）d。与对照组比较，OA组、FK506组和OA+FK506组移植肾的存活时间均显著延长，比较差异均有统计学意义（P

2.3 血清T细胞因子的浓度

如图3所示，术后第5天，与对照组比较，OA+FK506组和FK506组的IL-2显著降低（P

2.4 表达IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的T细胞频率

如图4所示，与对照组比较，各药物处理组表达IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的T细胞频率显著降低（P

3 讨论

以往的研究表明，OA是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物，广泛分布于自然界。OA以游离形式，或与糖结合的形式广泛分布于大约60个科190种植物中，如在青叶胆全草、白花蛇舌草、女贞果实等植物中，是一种活性氧和主要炎症相关酶的抑制剂，具有较强的抗炎作用[5-7]。

在移植物局部免疫微环境中，辅T细胞（Th1/Th2）的免疫调控作用是决定移植物生存时间的关键因素[8]。Th1细胞分泌IFN-γ和IL-2，Th2细胞分泌IL-4和IL-6等细胞因子，而前述细胞因子均为促炎细胞因子[9]。大量对Th1/Th2细胞因子的研究发现，IFN-γ和IL-2在细胞型排斥反应中起到关键作用，是观测排斥反应的重要指标[10-11]；而IL-4和IL-6可促进体液型排斥反应，也是观测排斥反应的重要指标[12-13]。本实验观察到，与OA和FK506单独处理大鼠相比，OA+FK506更能显著降低大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的浓度，下调大鼠表达IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的T细胞频率，提示OA可协同FK506抑制Th1/Th2细胞功能和数量，从而抑制细胞型和体液型急性排斥反应。在OA的单独干预下，上述实验指标的数据提示OA具有调节Th细胞功能和数量的作用，与Wang等[14]的报道相符，但这些作用是否与其抑制活性氧和主要炎症相关酶的药理学机制相关，还有待进一步研究。另外，OA+FK506更能显著延长大鼠移植肾的存活时间，延缓大鼠移植肾失功，验证了OA协同FK506减轻肾移植大鼠排斥反应的实际效果。

综上所述，OA能协同FK506抑制Th1/Th2细胞，减轻排斥反应，最终促进大鼠移植肾存活。在临床肾移植领域，OA具有协同FK506促进移植肾存活的潜力，但这还需要进一步的临床研究去验证。

参考文献

[1] Sánchez-Pérez J.Safety information for tacrolimus： resent and future[J]. Actas Dermosifiliogr， 2008， 99（2）： 19-25.

[2] 魏忠宝， 孙佳明， 飞， 等. 山楂叶悬钩子根抗氧化活性成分研究[J]. 中国中药杂志， 2012， 3737（23）： 3591-3594.

[3] Lee S. An improved technique of renal transplantation in the rat[J]. Surgery， 1967， 61（5）： 771-773.

[4] Kao G S， Wood I G， Dorfman D M， et al. Investigations into the role of anti-HLA class Ⅱ antibodies in TRALI[J]. Transfusion， 2003， 43（2）： 185-191.

[5] 张登科，孙文基，沙振芳. 35种植物的齐墩果酸含量比较[J].中药材， 1989，12（10）：17-19.

[6] Dinavahi R， George A， Tretin A， et al. Antibodies reactive to non-HLA antigens in transplant glomerulopathy[J]. J Am Soc Nephrol， 2011， 22（6）： 1168-1178.

[7] Pollier J， Goossens A. Oleanolic acid[J]. Phytochemistry， 2012， 77（5）： 710-715.

[8] Romagnani S. T-cell subsets （Th1 versus Th2）[J]. Ann Allergy Asthma Immunol， 2000， 85（1）： 9-18.

[9] Szymanowski K， Niepsuj-Binia? J， Dera-Szymanowska A， et al. An influence of immunomodulation on Th1 and Th2 immune response in endometriosis in an animal model[J]. Biomed Res Int， 2013， 19（7）： 849492.

[10] Briem-Richter A， Leuschner A， Krieger T， et al. Peripheral blood biomarkers for the characterization of alloimmune reactivity after pediatric liver transplantation[J]. Pediatr Transplant， 2013， 17（8）： 757-764.

[11] Tian C H， Liu Y G， Yan J K， et al. B-and T-lymphocyte attenuator/herpes virus entry mediator as early indicators for acute rejection following kidney transplantation[J]. Transplant Proc， 2013， 45（1）： 157-162.

[12] Tay S S， Plain K M， Bishop G A. Role of IL-4 and Th2 responses in allograft rejection and tolerance[J]. Curr Opin Organ Transplant， 2009， 14（1）： 16-22.

[13] Wang X， Xu X， Huang H， et al.Interleukin-6 first plays pro-then anti-inflammatory role in early versus late acute renal allograft rejection[J]. Ann Clin Lab Sci， 2013， 43（4）： 389-394.

[14] Wang J， Shan A， Liu T， et al. In vitro immunomodulatory effects of an oleanolic acid-enriched extract of Ligustrum lucidum fruit （Ligustrum lucidum supercritical CO2 extract） on piglet immunocytes[J]. Int Immunopharmacol， 2012， 14（4）： 758-763.

（收稿日期：2014-02-21） （编辑：黄新珍）