环糊精包合物表征手段的研究进展

摘要：环糊精分子具有独特的空间结构和高度选择性，在荧光分析、药物控制释放、手性识别、模拟酶、分子开关、超分子构筑等方面起着重要作用。环糊精与药物形成包合物后能大大增加药物的溶解度、生物利用度及实现靶向作用。现对研究环糊精和药物形成包合物的常用表征手段及其优缺点作一综述。

关键词：环糊精；包合物；表征

中图分类号：R943文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)07-0035-05

The Researching Progress of Exosyndrome Method Used in Studying Cyclodextrin Inclusion Complex

LI Xiang, LIN Xiu-li

(College of Pharmacy, Shan dong University, Jinan 250012, China)

Abstract：Cyclodextrin which has distinct molecular structure and many feasible derivatization makes it possible to design host moleculars which have special structure and higher selectivity according to their different purpose. These host moleculars play an important parts in the fluorescence analysis, drug controlled releasing, chiral recognition, mimic enzyme，molecular switch and supermolecular fabrication, etc. Cyclodextrin can improve solubility, bioavailability of drugs and realize targetting when it encapsulates drugs. Different methods for studying the inclusion complex between cyclodextrin and drugs are introduced in this paper. The advantage and disadvantage of the different methods are also discussed. The inclusion reaction between cyclodextrin and drugs is also prospected.

Key words：cyclodextrin; inclusion complex; exosyndrome

近年利用环糊精（cyclodextrin，CD）的“外亲水，内疏水”特性与药物及多种有机化合物形成包合物的研究备受关注。其原因是CD空腔尺寸与大多数临床使用的药物分子尺寸相适宜，形成的包合物稳定且无毒副作用，能增加脂溶性药物的溶解度，输送药物到特定靶点，在某种程度上还能增加药物的治疗效果。详细了解包合物形成的基本原理及其结构，对研究药物包合系统非常重要。目前研究环糊精和药物包合作用的手段较多，现对各种表征手段的原理、方法及其优缺点的研究进展作一综述。

1环糊精包合物常用的表征方法

1.1X射线衍射

X射线衍射法是确认分子是否被包合的有效方法，原理是各晶体物质在相同的角度具有不同的晶面间距，从而显示了不同的衍射图。一般来说，若包合物没有客体和CD原有晶体的衍射峰，而是出现与CD、客体分子以及主客体混合物完全不同的特征峰，就表明生成了包合物。Yap等[1]研究13-顺式视黄酸-HP-β-CD（HP意为羟丙基）包合物的理化性质，X射线衍射图中13-顺式视黄酸是晶形结构，出现一系列强烈尖锐的衍射峰，而HP-β-CD是非晶形结构不出现衍射峰，二者的物理混合物出现类似13-顺式视黄酸的衍射峰，而包合物衍射图未出现衍射峰。表明13-顺式视黄酸与HP-β-CD形成了一个新的非晶形结构固相，即包合物形成。X射线衍射法还可确知主客体分子精确的几何关系及相互作用。Scalia等[2]用X射线衍射法测得包合物固相特征，确定了包合的最佳方法，并证明当主体CD的浓度超过防晒剂浓度10倍时，防晒剂进入CD的空腔形成完全包合。

X射线衍射虽能有效地确认分子是否被包合，但技术较复杂，只适用于固体包合物的分析。

1.2紫外-可见吸收光谱法

紫外-可见光谱用于表征主客体相互作用的基础是客体包合到CD后，CD空腔内的高电子密度诱导客体分子电子移动，吸收波长和吸收度发生不同程度的变化。紫外分光光度法通过两种方法测定包合物的组成比，一是连续变异法（Job法），其基本原理是维持总摩尔数不变，改变CD和客体分子的比例，当2种组分的摩尔分数之比等于包合物组成比时，包合物的浓度最高；二是摩尔比法，即保持客体分子浓度不变，不断增加CD浓度配制一系列包合物溶液，测定吸光度，最大吸光度所对应的摩尔比即为包合物的组成比。确定化学计量之后，用Hildebrand-Benesi方程及其改进式计算包合物的稳定常数，利用UV-vis光谱变化的本质研究包合物结构和相互作用。Dotsikas等[3]用紫外分光光度法研究了6-对-酰替甲苯萘胺-2-磺酸盐（TNS）同β-CD在水溶液中的相互作用。先用连续变异法确定了包合物的化学计量比为1:1，再用线性和非线性模型观测β-CD浓度不断增加时TNS的图谱特征，计算包合物的动力学参数和稳定常数。这种模型只需TNS和CD的初始浓度而不受其他条件限制，因此可以避免实验和理论上的缺陷。

紫外-可见分光光度法学虽能测定溶液中包合物的稳定常数和表观热力学参数，但灵敏度低，只适用于有适当强度的紫外吸收的药物。

1.3荧光光谱法

荧光光谱法灵敏度较高，是研究CD包合物的常用技术。客体分子与CD形成包合物后，其激发波长、发射波长及荧光强度会产生相应变化，其中荧光强度增强的原因有，（1）环糊精结构构象能保护客体分子的荧光激发单重态和磷光三重态，使之不受水溶液或溶剂中促灭剂的影响，且CD空腔内局部黏度增大，氧对客体分子的荧光促灭作用随之降低；（2）客体分子发色团的微环境极性改变导致量子产率增加；（3）包合物形成后，客体分子的运动自由度降低，相互碰撞机会减少，非辐射衰减变弱，荧光强度增加。利用荧光光谱研究药物分子与CD结合常数的方法较多，有双倒数法、荧光偏振法、时间分辨荧光法、相分辨荧光法及荧光各相异性法[4]，其中双倒数法可以提示客体与CD之间的多级包合，其表达式如下：

[G]0[CD]/F=1/(K×a)+[CD]/a

1/F=1/(K×a×[G]0)×1/[CD]+1/(a×[G]0)

[G]0为客体的总浓度，F为加入CD后荧光强度较无CD时的变化值（实际上是指包合物的荧光强度），a为常数。

实验中，以1/F对l/[CD]作图，从所得直线的斜率和截距求得K，方法简便。用Benesi-Hildebrand法的前提必须是[CD]远远大于[G]0，且假设溶液中只有1∶1包合物形成。张海容等[5]用荧光法研究了甲醇、正丙醇与α-萘酚、β-CD的形成，证明三者形成1∶1∶1三元包合物，并用双倒数测定了两种包合物各自的包合常数。但此法的实验误差随CD浓度的增大而增大。荧光偏振法可用于研究客体分子在腔内的刚性化程度，进而推测主客体分子的包合强度及空间匹配程度。Khajehpour等[6]用稳态-时间分辨荧光法、偏振荧光法发现CD衍生物易与暴露在水溶液表面含有疏水斑的多肽、蛋白质类结合；嵌在CD环内黏性斑的合并能阻止蛋白质的相互聚集。荧光各相异性法利用荧光体在包合前后的荧光各向异性值的变化来测结合常数，还可判断CD包合物的形式及存在形式。Baneriee等[7]用同步荧光法和荧光各相异性法解决了包裹在CD主体内部的吡罗昔康质子移变形式和化学键合量论的争论，并且利用三种昔康类非甾体抗炎药的内源荧光鉴别了包含在β-CD空腔内主要的质子移变形式，计算了包合物的化学计量比和结合常数。此法只适于包合前后荧光强度变化小的情况。

荧光法虽简便易行，但只局限于有荧光的物质。此外，时间分辨荧光法、相分辨荧光法虽新颖简便，准确度高，但设备昂贵，限制了普遍使用。

1.4红外光谱法

红外光谱可用于确认有无包合物生成。由于CD在4 000～400 cm-1范围内吸收峰很强，容易掩盖客体分子的吸收峰，故通过主体、客体、主客体混合物、包合物吸收峰的变化就可确知是否生成了包合物。其中包合物的图谱与单纯的主客体图谱有较大差别，它不仅有谱峰位移，而且有新峰出现。若客体分子有羧基、羰基等特征基团，则1 700 cm-1附近伸缩振动峰的波数变化可以提供客体分子是否进入空腔以及相互作用的证据。Yap等[1]研究13-顺式视黄酸-CD包合物的理化性质时，红外光谱图显示，13-顺式视黄酸有归属于C=O和C-O的伸缩振动峰，HP-β-CD有归属于O-H的伸缩振动峰，物理混合物的红外光谱图类似于两个单体图谱的叠加，而包合物的羟基氢键伸缩振动峰发生位移，并且物理混合物出现的1 700～1 500 cm-1谱带强度在包合物中明显降低，表明包合物形成；羟基氢键伸缩振动峰发生变化是因包合物形成后，HP-β-CD筒状结构窄边羟基的氢键受到了破坏。

此法虽能鉴别客体分子是否与CD包合，但不能提供包合物的类型（包埋还是吸附）及分子结构，且样品消耗量较大。

1.5圆二色谱法

圆二色谱是研究具有光学活性化合物结构的有效方法，非手性客体分子在CD手性空腔诱导下引起手性改变，产生诱导圆二色信号（ICD）。所以圆二色谱适合研究环糊精与客体分子的包合方式，包合行为的依据是扇形规则：客体生色基团偶极矩的跃迁平行于CD的对称轴时，ICD谱跃迁带的Cotton效应（CE）为负；当其垂直于CD的对称轴时，CE为正；当其与CD空腔的对角线重合时，CE的旋转强度为零。Nagase等[8]根据无光学活性物质进入CD空腔能在客体发色基团的波长区域产生外援性科顿效应的原理，证明了DY-9760e嵌入磺丁基-β-环糊精（SBE-β-CD）和羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）的空腔，形成包合物；由扇形规则得出DY-9760e结合位点3-氯-2甲苯优先嵌入CD空腔内，H值不同时，嵌入方式也不同。圆二色谱带不但能判断包合物是否形成，还可计算出包合比和包合常数。

Calabro等[9]用圆二色谱法测定芦丁和β-CD在水溶液中的包合常数，获得了包合比为1∶1时的包合常数。

此法简便易行，不但能确定包合物是否生成，而且能判定包合物的类型及包合常数，是推测溶液中包合物结构及其组成很有用的物理化学方法。但给定时间内光谱收集的信噪比较高。

1.6热分析法

常用的有差示扫描量热分析法（DSC）和热重分析法（TGA），通过比较客体分子、CD、客体分子与CD混合物、包合物的吸热峰位置变化情况和失重情况探知包合物是否形成，并能通过DSC数据测得包合物的热力学参数和包合常数。Bettinetti等[10]用DSC和TGA法评价了萘普生与非晶形CD衍生物形成固体包合物的相互作用，由DSC和TGA图谱的变化表明4种CD都与萘普生形成了包合物；又从DSC数据算出了各包合物的包合比和包合常数。

热分析法虽能测定主客体是否包合及包合物的稳定性，还可用Kissingerhe和Ozawa方程计算包合物的活化能、指前因子等参数，但不能测出主客体包合模型。

1.7核磁共振法

核磁共振（NMR）是研究包合物生成、空间构象、客体分子在空腔内的方位及包合位点的最强大工具，可分为一维核磁和多维核磁。其基点是：若客体分子积聚在CD空腔中，则CD空腔内侧氢原子H3、H5被客体所屏蔽，其化学位移会有变化，而外侧的H2、H4、H6不受影响。Nishijo等[11]用1H-NMR和CPK原子模型方法证实了胆固醇与7(2，6-二甲氧基)-β-环糊精(DOM-β-CD)形成1:2可溶性包合物的结构。1H-NMR显示环糊精腔内的H3、H5、H6的质子信号向高场移动，外侧的H1、H4的质子信号也向高场移动，6-OME和2-OME基团的质子信号则向低场移动。结合CPK原子模型确定了包合物（1:2）可能有3种结构。Nishijo等[12]用同样方法证实了胆固醇与7(2,3,6-三-甲氧基)-β-环糊精(TOM-β-CD)的包合行为，并用ROESY图谱验证。一维核磁虽能提供一些有价值的信息，但当相对分子质量增加时，稳态NOE只能提供弱的甚至无效的增强作用，二维ROESY能克服这个问题，因为其增强作用总是正性的。但它有时给出一些小峰，很难判断它们是真峰还是假峰。一维梯度加强的ROESY（即GROESY）可简单有效地检测NOE加强作用，因此，要获得比较详细的复合物图谱需用多种NMR检测方法。Perry等[13]用多维NMR法确定溶液中形成包合物的理化性质和结构；2D-ROESY，2D-NOESY，1D-1H数据表明，β-CD的疏水腔与对羧基苯甲醚的三呃烷环和芳香环作用，包合比是2:1，但没有排除溶液中其他包合比包合物的存在。青蒿酸-β-CD包合物的2D WATER-GATE-ROESY图谱表明，青蒿酸同β-CD以1:1的比率包合，同样，NMR收集的数据也不能排除溶液中其他包合比包合物的存在。

NMR法适用范围广，可利用的数据多，如化学位移、偶合常数、振动弛豫等，并可同时观察CD与药物的参数变化。但仪器价格昂贵，空间调节剂或第三组分的干扰或多或少地影响K值测定等缺点限制了此法的推广和应用。

1.8质谱法

质谱以其高效、快速、灵敏等独特优点在研究非共价主客体相互作用中起着越来越大的作用。随着“软电离”技术的发展，许多液相结合行为在质谱中可以得到很好的维持，但电离时很容易在气相中形成非特异性复合物。为消除这些非特异性复合物的干扰，需要仔细控制质谱的操作条件和溶液的浓度。曹书霞等[14]用ESI-MS考察4种蛋白质与β-CD作用，发现不同源内碰撞能量形成复合物的相对强度发生较大变化，源内碰撞能量越低，复合物的离子峰越强，得出源内碰撞能量是检测非共价复合物重要参数的结论。张敏等[15]考查了基体化合物对MALDI-TOF-MS质谱图的影响，表明有的基体本身可以形成离子峰很强的复合物，干扰了峰的形成，不利于确定复合物准分子离子峰，可见质谱研究主客体相互作用时调节好操作条件非常重要。此外，质谱方法研究非共价复合物时，溶液中与气相中主客体相互作用是否一致值得关注。Wen等[16]根据ESI-MS中气相态合成物与溶液行为呈正相关关系，成功地评价了液态CD的分子识别和包合过程等特性，并用相溶解度法和制作分子模型法进一步验证结果一致，表明质谱在表征非共价结合时能保持液相的特性。

虽然质谱法研究非共价复合时可能存在溶液中与气相中主客体相互作用不一致的情况，有时还可能在气相中形成非特异性复合物。但是，质谱法快速、灵敏，对样品的要求不苛刻，而且样品消耗量少，有望成为研究主客体相互作用的主要工具。

1.9毛细管电泳法

毛细管测定包合常数常用的方法有淌度移动法（电泳峰漂移法）、部分填充法、配体分离法、前沿分析法。淌度移动法是通过测定含有不同主体浓度的缓冲溶液中客体的电泳淌度（或迁移时间）的变化，或通过将客体加入缓冲液，测定主体电泳淌度（或迁移时间）来计算包合常数。此法对受体的纯度要求低，应用较广泛。Trentin等[17]用毛细管区带电泳淌度移动法研究了pH9的磷酸盐缓冲溶液中硫辛酸与CD及其衍生物的相互作用，数据分析前校正电泳迁移率。结果表明，毛细管区带电泳是测定硫辛酸和CD衍生物包合常数的一种简单、可靠、快速的方法，能测定出硫辛酸与天然CD及CD衍生物包合物的包合常数。其中容易获得的β-CD是包合硫辛酸最合适的主体分子。但是，电泳淌度法测定包合常数必须满足客体分子与CD-客体包合物的电泳淌度存在差异的要求。李晓峰等[18]在二元环糊精体系中采用毛细管电泳法测定β-CD与中性化合物包合常数的，无需电泳淌度存在差异。此法分为两步，先在一元环糊精体系中测定硫酸化环糊精（SCD）和中性客体的包合常数，然后用含有CD和固定SCD的二元环糊精体系测得CD与中性客体的包合常数。

毛细管电泳是一种新型的分离分析技术，高效、快速、微量，是一种研究CD和客体相互作用的可靠方法。但此法影响因素较多，因此重现性低。

1.10高效液相色谱法

CD在高效液相色谱体系中通过与客体分子包合的不同程度发挥作用，这种包合作用产生提高色谱法选择性的不同保留行为，而保留行为的变化与包合物的稳定常数密切相关。因此，可用主客体包合物的稳定常数来解释包合物在反相液相色谱中的保留行为，研究CD与客体的包合作用。反相HPLC法应用CD及其衍生物的研究分为两种，第一种是化学键合的CD-硅胶为固定相。阮源萍等[19]将合成的2,6-O-丁基-β-CD动态涂渍反相色谱柱，β-CD在填料表面永久吸附形成手性固定相，高效液相拆分联萘二酚和苯基琥珀酸。手性固定相法虽然操作简单，但手性柱使用寿命短，消耗大。现在常用第二种方法，即CD或具有高溶解度、经修饰的CD作流动相的添加剂。不同浓度CD溶液加入流动相时，溶质在色谱中的保留是由其在固定相、流动相和与CD形成溶质络合物的分配比决定的。Gazpio等[20]用反相液相色谱法测定了吲哚、4-甲氧基吲哚、吲哚洛尔与环糊精的表观包合常数，并与荧光法、分光光度法获得的数据比较，结果表明，此法能准确地反映主客体相互作用的包合常数。但手性流动相法测定包合常数易受流动相系统溶剂的干扰。陈德英等[21]研究了不同色谱条件下HP-β-CD作为RP-HPLC手性添加剂对盐酸舍曲林异构体的手性选择包合和色谱保留行为的影响，通过1/k对HP-β-CD浓度的直线求得包合常数，定量描述包合常数与缓冲液浓度（离子强度）、pH值、乙腈溶剂强度及温度之间的关系。

高效液相法的优点在于样品用量少，简便快速，但只能用于包合后可引起保留时间显著变化的体系。

2展望

CD对包合药物的分子大小有限制，水中溶解度较低，在应用上有一定的局限性。与母体CDs相比，CD衍生物在增溶、稳定药物和减少溶血现象等方面有很大改进。越来越多性能更好、用途更广的CD衍生物被开发。因此，研究新型CD衍生物与药物的包合作用，不仅有助于从理论上阐明药物结构与性能的关系，而且可以提供理想的缓控释制剂和靶向制剂的载体。

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