改良法制作兔VX2骨肿瘤模型的实验研究

摘要：目的 通过比较改良法与传统法制作兔VX2骨肿瘤模型，明确改良法可明显改善肿瘤细胞经骨孔外渗情况。方法 取传代VX2肿瘤荷瘤兔，将肿瘤制备成肿瘤组织块，分别植入22只成年家兔双侧胫骨内制成兔VX2骨肿瘤模型。所有家兔左侧胫骨采用改良法植入肿瘤组织块，即通过套管植入肿瘤组织并给予骨蜡封堵；而所有右侧胫骨直接经穿刺骨孔植入肿瘤组织块。模型制作3w后，给予所有家兔患肢行彩色超声检查，明确有无软组织包块形成；同时处死家兔，取骨孔周围软组织行病理检查，明确有无肿瘤细胞转移。结果 造模3w后，双侧胫骨成瘤率100%。超声显示左侧组发现软组织包块2例，右侧组6例；病理检查示左侧组肿瘤细胞经骨孔外渗率（23%，5/22小于右侧组（55%，12/22）。将两组穿刺骨孔肿瘤细胞外渗率进行比较，差异有统计学意义（χ2=4.69，P

关键词：VX2肿瘤；骨肿瘤；模型；病理学

Study on the Improved Method in Establishment of VX2 Bone Tumor Model in Rabbit

CAO Hai-ying，FENG Zhen，WEI Jun-qiang，ZHAO Jing-xin，YU Tao，JIN Yu

（Chengde Medical College， Chengde 067000，Hebei，China）

Abstract：Objective To investigate the efficacy between the traditional method and the improved method in establishment of VX2 bone tumor model in rabbit in order to prove the improved method can improve tumor cells spreading. Methods After separating the VX2 tumor from cancer bearing VX2 rabbit， the tumor tissue blocks were prepared. the tissue blocks were embedded into the right tibias 22 rabbits through the puncture hole ，and all the puncture holes were closed by bone wax. Color Doppler Ultrasound was used to assess the soft enclosed mass near the puncture hole after 2 weeks. The pathological study also was carried out for the soft tissue near the holes after 14 days. Results Only 2 cases from the left group showed the soft mass around the puncture holes after 14 days， but there were 6 cases around the puncture holes of all the 22 cases of the right group. The pathological showed there were 5 cases（23%，5/22） that we can find the tumor cells in the soft tissue around the puncture hole in the left group， but 12 cases（55%，12/22）in the right group. The difference was statistically significant（χ2=4.69，P

Key words：VX2 tumor；Bone tumor；Model；Pathology

目前由于我国人们生活方式及环境因素的改变，肿瘤特别是骨肿瘤的发病率呈逐年升高趋势。VX2肿瘤一种可移植的恶性状瘤，可移植在兔的肝脏，肺脏，骨骼肌肌肉等处，所建立的肿瘤模型具有较高的生物学特性[1～3]。由于VX2肿瘤对兔骨质的侵犯及破坏作用与人类骨肿瘤较为类似，兔VX2骨肿瘤的研究备受学者青睐。良好的兔骨肿瘤模型是实验研究成功的第一步，然而造模过程中经常遇到肿瘤细胞经骨孔外渗等困难。本实验中，通过改良法与传统法植入肿瘤细胞制造兔骨肿瘤模型对比，明确改良法可改善肿瘤细胞经骨孔外渗情况。

1 资料与方法

1.1实验动物 新西兰成年家兔22只，月龄4个月，体质量2～3kg，雌雄不限，所有动物进行标准兔舍圈养，卫生水及标准兔饲料喂养。本实验遵循承德医学院实验动物保护及使用规定，遵循医学伦理学要求。

1.2实验器材及仪器 超声诊断扫描仪采用Medical Systems-LOGIQ9（GE公司，美国）；OLYMPUS-BX53光学显微镜（OLYMPUS公司，日本）；VX2肿瘤株由广州吉妮欧生物试剂公司提供。

1.3兔VX2肌肉肿瘤模型制备

1.3.1肿瘤细胞悬液及瘤块组织制备 取传代荷瘤VX2种兔1只，经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg）麻醉后，瘤区去毛俯卧位保定于操作台上，剪开皮肤，分离皮下组织、肿瘤，将肿瘤完整取出；将肿瘤置于37℃磷酸盐缓冲液（PBS）中，仔细分离肿瘤组织，去除坏死及周围纤维组织；无菌条件下将肿瘤组织剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，以上操作均于超净工作台内完成。

1.3.2骨肿瘤模型制备 经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg）麻醉后，分别给予所有家兔后肢毛发去除，俯卧位固定于操作台上，常规碘伏消毒，铺无菌孔单。于胫骨干骺端内侧较平坦处作1cm长皮肤切口，分离皮下组织暴露胫骨后，用1.6mm克氏针经胫骨近端关节面穿刺，克氏针与胫骨长轴平行，将克氏针送入胫骨上段髓腔2cm左右。将直径为1.5mm套管插入左侧胫骨骨孔，将少许肿瘤组织块沿套管植入，应用顶棒将其顶入髓腔内。然后拔除套管，骨蜡封堵骨孔（见图1）。同时，用无菌镊夹持肿瘤组织块少许（与左侧相等），直接放入右侧骨孔内，然后给予骨蜡封堵骨孔。给予骨孔周围酒精擦拭，逐层缝合切口。

图1 改良法植入肿瘤组织示意图：a示将套管插入骨孔，b示将顶棒将肿瘤组织块经套管植入髓内，c示肿瘤组织块植入髓内后，骨蜡封堵骨孔。

1.4超声评估 模型制备21d后，给予所有家兔双胫骨部位行超声检查，明确穿刺骨孔周围有无软组织包块形成。

1.5病理检查 模型制备21d后，经耳缘静脉空气栓塞法处死所有家兔，取胫骨穿刺骨孔外软组织并浸泡于4%甲醛溶液中固定，然后进行石蜡包埋，切片并进行HE染色，与病理学医师共同探讨镜下结果，将左侧组、右侧组病理结果进行对比分析。

1.6统计学分析 应用统计学知识，将左、右侧组肿瘤细胞骨孔外渗率进行χ2检验，以P

2 结果

2.1超声检查结果 模型制备21d后，超声检查时左侧组骨孔旁软组织发现包块2例，右侧组6例。

2.2大体解剖结果 模型制备后21d后，处死家兔，对所有家兔下肢进行解剖，发现胫骨成瘤率100%，左侧组发现骨孔周围软组织包块2例，右侧组6例，同超声检查结果相符。

2.3病理检查结果 取骨孔外软组织行病理检查，左侧组骨孔周围软组织发现肿瘤细胞5例，右侧组发现肿瘤细胞12例，显微镜下可见外渗的肿瘤细胞核大深染，胞质较淡（见图2）。将左侧组与右侧组肿瘤细胞经骨孔外渗率进行χ2检验（见表1），χ2=4.12，P

图2 a示正常肌肉组织在HE染色低倍镜（×10）下观察未见肿瘤瘤细胞转移的病理图片；b穿刺骨孔周围软组织经HE染色后高倍镜（×40）下观察可见肿瘤细胞转移，可见肌肉组织中含核大深染的肿瘤细胞

3 讨论

近年来随着我国经济的发展、人民生活方式的改变，恶性肿瘤已成为中国居民死亡的主要原因，骨肿瘤的发病率也呈逐年升高趋势。早期发现、正确诊断、及时治疗对肿瘤预后有着重要影响[4]。

兔VX2肿瘤是由Shope病毒在兔皮肤上诱发状瘤衍生的鳞状细胞癌，经历72次传代培养后仍可种植于家兔体内的肿瘤细胞株，具有生长迅速、容易移植、侵袭性强、造模成功率高等优点[5，6]。新西兰种属兔缺乏针对该肿瘤抗体，VX2肿瘤细胞可接种在兔的肝脏、肺脏，大脑，肌肉及骨骼等处，所建立的肿瘤模型具有较高的生物学特性[7～9]。由于VX2肿瘤对兔骨质的侵犯及破坏作用与人类骨肿瘤较为类似，许多学者应用其模仿人转移性骨肿瘤来研究[10]。

目前VX2肿瘤模型制作常用两种方法，一种方法是将肿瘤组织经过离心、细胞计数等制作成肿瘤细胞悬液，注入需要相应器官或组织内。另一种方法是将肿瘤组织碎块剪成碎块，然后通过外科手术方式植入相应器官或组织内。在制作VX2肝癌模型中，有研究[11]认为组织块包埋组制作的肝癌肿瘤模型较细胞悬液相比具有肿瘤形状规则，生长较均一等优点，但在骨VX2肿瘤模型制造中，肿瘤组织块植入法制作骨肿瘤模型应用较为广泛。由于胫骨髓腔内压力与外界不同及髓内出血等因素，当肿瘤组织植入髓内时易被溢出而污染骨孔周围软组织，导致实验失败，而本实验目的在于应用一种新的方法来将肿瘤组织植入骨孔内，避免或改善肿瘤细胞经骨孔外渗情况，从而避免骨孔周围软组织污染。

本实验将VX2肿瘤组织分别在无菌条件下制成肿瘤组织碎块，并将其通过外科手术方式分别植入22只新西兰大白兔双侧胫骨髓腔内。左侧胫骨在植入肿瘤组织块时，先将自制的管径略小于骨孔的金属套管插入骨孔内，在将肿瘤组织碎通过套管植入家兔胫骨髓腔内，然后拔除套管，用骨蜡给予骨孔封堵。右侧组应用无菌镊夹持少许肿瘤组织块直接经骨孔植入胫骨髓腔内。改良法的优点在于应用金属套管插入骨孔的同时，对骨孔产生了物理隔离，在肿瘤组织块植入过程中，避免肿瘤组织被髓内血液溢出或残余肿瘤组织留在骨孔外而污染骨孔周围软组织的可能。而建模后14d的病理检查也验证这一结论，建模后14d取骨孔周围软组织，行病理检查示改良法植入组有5例发现骨孔周围软组织有肿瘤细胞浸润，而传统法组发现有12例。发现肿瘤细胞浸润的软组织显微镜下可见瘤细胞呈圆形或不规则形，核大深染，核分裂像多见，细胞排列紊乱，细胞间质少。对两组骨孔肿瘤细胞外渗率进行χ2检验，差异具有统计学意义，说明改良法植入肿瘤组织块制作骨肿瘤模型可明显改善肿瘤细胞外渗情况。

同时，改良法植入肿瘤组织块制作VX2骨肿瘤模型操作较为简单，具备一般外科基本操作技能即可完成，是一种理想的VX2骨肿瘤模型制作方法。

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