镉损伤肝细胞体外模型的建立

摘要 在建立大鼠原代肝细胞体外培养的基础上，研究了不同浓度的醋酸镉对肝细胞存活率的影响。在原代肝细胞体外培养的不同时间点（4、7、10、24 h），用不同浓度的醋酸镉（0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L）处理3 h，MTT法测定细胞的相对存活率。结果显示，随着镉剂量的增加，细胞的相对存活率降低。当醋酸镉浓度为4.0 μmol/L，细胞的相对存活率为78.35%，与对照组有极显著性差异（P

关键词 镉；肝细胞；大鼠

中图分类号 O612.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）22-0241-03

Establishment of the Cadmium-induced Hepatocyte Damage Model

YANG Jian-quan 1 NI Hui 2 WANG Ling-ling 2 HAN Tao 2 LIU Xue-zhong 2 *

（1 Rudong Animal Husbandry Station of Nantong City in Jiangsu Province，Nantong Jiangsu 226400； 2 College of Veterinary Medicine，Yangzhou University）

Abstract In this study，the rat primary hepatocyte culture system in vitro was used to study the changes of cell viability in different concentrations of cadmium. In primary hepatocyte cultured at different time points in vitro（4 h、7 h、10 h and 24 h），which were incubated with cadmium acetate of different concentrations（0 μmol/L，0.5 μmol/L，1.0 μmol/L，2.0 μmol/L，4.0 μmol/L） for 3 h.The results of MTT assay showed that Cd reduced the motility rat of primary hepatocytes at dose-dependant. After exposed to 4.0 μmol/L cadmium，the cell motility decreased to 78.35%，showing a significantly difference from the control group（P

Key words cadmium；hepatocyte；rat

镉损伤分子机制的深入研究依赖于肝细胞体外培养的良好模型。对大鼠原代肝细胞进行体外培养的方法较多[1-4]，试验室多采用直接剪切法[5]、组织块消化法[6]和两步胶原酶灌流法[7-8]等方法。肝细胞进行体外培养时，存在增殖能力小、原代培养的细胞死亡率高等缺点，不利于干细胞体外模型的使用和推广[9]。在实验室中，胶原酶灌流法也是一种效果较好的干细胞分离法，但采用该方法，操作复杂，技术要求高，不能广泛推广使用[3]。该文在原有的基础上对胶原酶灌流法进行优化，目的是寻找一种可以在实验室推广的、操作简单的、分离效果好的大鼠原代肝细胞体外培养方法，并进一步建立镉损伤肝细胞的体外模型。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物。试验用的动物来自江苏大学实验动物中心，是健康雄性SD大鼠，体重180～220 g/只。

1.1.2 试剂及仪器。Williams′Medium E（WME），胰岛素，醋酸镉[Cd（CH3COO）2·3H2O]，青链霉素（Penicillin/streptomycin）：Sigma-Aldrich，USA；L-谷氨酰胺（L-Glutamine），胰蛋白酶（Trypsin），噻唑兰（MTT），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）：Amresco，USA；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：Gibco，USA；其他相关试剂均为国产分析纯[10-11]。

台式高速冷冻离心机，型号为5810R，Eppendorf，Germany；超纯水制备装置PS-9000705，Labconco，USA；电子天平BS210S：Sartorius，Germany；倒置相差显微镜AE21：Leica，Germany；酶标仪sunrise-basic：Tecan，Australia；PH计：Mettler Toledo，Switzerland；二氧化碳培养箱HF90：Thermo，USA；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140A，电热恒温水槽DK-600型，由上海精宏实验设备有限公司生产；漩涡振荡仪ZW-A，由江苏金坛荣华仪器有限公司生产；超净工作台SW-CJ-1FD，由苏州净化设备有限公司生产[10-11]。

1.2 试验方法

1.2.1 大鼠肝细胞的分离。在试验过程中，以Seglen[12]两步胶原酶灌注法为基础，对试验方法进行优化和改良，以使分离后的肝细胞数量多，存活率高，活性强。在24 h内不对SD大鼠进行饲喂，对其进行麻醉。麻醉的方法为腹腔注射，麻醉使用的药剂为2%戊巴比妥钠（40 mg/kg·体质量），麻醉时注射肝素钠抗凝；将大鼠固定，腹部皮肤消毒，沿腹中线打开腹腔，将肠拨到左侧，暴露肝门静脉和下腔静脉，在肝脏表面铺一块用37 ℃ PBS浸润的纱布，并在灌流过程中用37 ℃的PBS不断浸润，保持肝脏温度利于胰酶的消化[10-11]；在肝门静脉的近心端和远心端分别结扎缝合线，留置针插入门静脉，缓慢抽出针芯，若回血，说明插入正确，将缝合线扎紧，将输液器连接留置针，剪开下腔静脉近心端，用37 ℃预热 D-Hanks液以流速为25 mL/min开放灌流约12 min，冲掉肝脏内的血细胞，待肝脏变为土黄色后，改用37 ℃、含0.18%胰酶的D-Hanks液以流速为25 mL/min继续灌流7 min，肝脏由土黄色变为白色；取下完整的肝脏，用含双抗（100 kU/L青霉素和100 kU/L链霉素）的PBS清洗3次，放入含双抗和1%BSA-Hanks液中终止胰酶消化，并用眼科镊分离肝组织，去除肝包膜及血管等结缔组织，收集肝细胞悬液，分别用100目、200目的筛网过滤肝细胞悬液，600 r/min离心5 min，去除上清液，用1%BSA-Hanks液重悬沉淀，500 r/min离心5 min，去上清，沉淀中加入含100 mL/L胎牛血清、100 kIU/L青霉素和100 mg/L链霉素的WME完全培养基重悬，500 r/min离心5 min，用WME完全培养基重悬沉淀得到肝细胞悬液。

1.2.2 肝细胞的产量及活率的测定。肝细胞产量的测定仪器为显微镜，测定过程中使用血细胞计数板；肝细胞的活力测定方法为台盼蓝排斥法。将肝细胞悬液与0.4%台盼蓝混合（其比例为9∶1），运用显微镜计算未染色细胞数目和细胞总数，统计未染色细胞占细胞总数的百分比，计算细胞活率。

1.2.3 肝细胞体外培养。试验前先用鼠尾胶原包被培养板备用，用含10% FBS的WME培养液调整细胞密度为6×105个/mL，六孔培养板接种2 mL/孔，96孔培养板接种100 μL/孔，置37 ℃、5% CO2培养箱培养4 h贴壁后，进行换液，换液过程中要用滴管轻轻吹打，将死细胞及未贴壁的细胞除去，一般的换液间隔时间为12 h。

1.2.4 肝细胞形态学观察。试验过程中用倒置显微镜对分离纯化和接种的肝细胞进行形态学观察并拍照。

1.2.5 MTT法确定Cd处理浓度。96孔板培养原代大鼠肝细胞，接种密度2×104个/孔，培养24 h后，设立调零孔（WME、MTT、DMSO、无细胞），其他孔染镉浓度一次为0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L，每个剂量设6个重复孔，染毒培养4 h。

96孔板培养原代大鼠肝细胞，接种密度2×104个/孔，用4 μmol/L醋酸镉在肝细胞培养4 h、21 h点处理肝细胞3 h，分别标记为7 h与24 h的镉处理组与对照组。

染毒后弃去含镉培养液，加入含5 mg/mL MTT的培养液到试验孔中，100 μL/孔；用铝箔纸包起培养板，在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育4 h后，弃去上清液，加入DMSO，150 μL/孔，充分振荡10 min，使MTT-甲臜颗粒充分溶解，酶标仪测定490 nm处吸光光度值。计算细胞的存活率。

2 结果与分析

2.1 肝细胞体外培养的形态学观察

将显微镜倒置，对刚分离的大鼠肝细胞形态和培养4 h的大鼠肝细胞形态进行观察。从试验结果来看，刚分离的肝细胞形态形态完整、分布均匀、饱满、透光度好，呈光亮圆形，胞核清晰（图1）；培养4 h后，换液的细胞，大部分细胞已贴壁生长，细胞饱满，胞核清晰，呈单核或多核细胞（图2）。

2.2 肝细胞的产量及细胞活率

在细胞刚刚分离后，运用台盼蓝排斥试验，统计其肝细胞总数。台盼蓝染色的大鼠肝细胞形态如图3所示，活细胞的胞浆及胞核均排斥染色，整个细胞拒染，呈透亮无色，超过90%的细胞能够存活。计数得出平均每只大鼠肝脏可获得约2×109个肝细胞。

2.3 Cd染毒剂量的确定

将原代培养24 h的大鼠肝细胞暴露于不同浓度的醋酸镉，采用MTT法测定镉对肝细胞存活率的影响，如图4所示，镉处理组肝细胞存活率均受到不同程度的抑制。与对照组相比，Cd浓度为4.0 μmol/L处理3 h后，细胞相对存活率为（78.35±7.87）%，差异极显著（P

倒置显微镜观察4.0 μmol/L醋酸镉处理肝细胞的形态，结果发现细胞胞质皱缩，细胞核不清晰，有的胞核碎裂（图5）；而对照组细胞牢固地黏附在胶原上，拉平变薄，体积增大，呈多边形展开，有些细胞开始呈片状岛状连接（图6）。

在此基础上，肝细胞体外培养4、7、21 h时，分别添加4.0 μmol/L醋酸镉处理3 h，即7、10、24 h的镉处理组及相应时间的对照组。MTT检测细胞的存活率，如图7所示，细胞培养4、7、10、24 h的对照组中，7、10、24 h的细胞存活率没有显著差异性，且细胞存活率均极显著低于4 h组；细胞培养7、10、24 h的镉处理组与同时间的对照组相比较，细胞存活率均极显著降低（P

3 结论与讨论

3.1 原代大鼠肝细胞体外模型的建立

目前，原代肝细胞培养已应用于许多毒理学方面的研究，其中较为重要的就是结合细胞功能和细胞毒性的研究方法来研究肝脏毒性损伤机制。相对于肝细胞系来说，原代肝细胞更加贴近体内肝脏的代谢状况，更能反映出机体中肝脏的排毒功能及损伤机制，因此原代肝细胞是一个较好的研究模型[12-13]。

传统的肝细胞原代培养方法由于操作较为复杂，经过反复试验，研究人员对分离方法进行改进，获得了高活率和高产率的肝细胞。肝细胞分离培养的影响因素很多，例如SD大鼠的年龄、取材时的室温以及维持灌流液的温度等都会对肝细胞的生长状态造成影响。在试验过程中，为了对肝细胞进行分离和培养，选择规格为200 g/只的SD大鼠，肝脏灌注时使用的酶为胰酶，能够使分离后的肝细胞纯度和存活率都较高。在试验过程中，要确保胰酶的浓度适宜。如果用低浓度的胰酶进行处理，分离后的肝细胞中会有过多杂细胞和结缔组织。反之，如果用高浓度的胰酶进行处理，会对肝细胞产生不良影响，影响存活率。经过试验证明，采用浓度为0.18%的胰酶，在37 ℃条件下灌流能够达到较好的效果。接种密度是影响分离后干细胞的存活率和后续试验的重要因素，该试验过程中采用的接种密度为6×105个/mL，取得了较高的细胞存活率。为了使细胞的纯度和存活率都较高，在试验过程中要进行换液，换液时间一般为接种后4 h，换液的仪器为滴管。培养液的成分会影响细胞的增殖和分化，为了达到较好的效果，要在WME培养液中添加胰岛素、地塞米松及胎牛血清。

通过试验建立的大鼠干细胞体外培养模型，具有操作简单、可分离大量干细胞、分离后的干细胞纯度和存活率高、接种后短时间（4 h）内就能够单层贴壁生长、在一定的体外培养条件下依然能够保留体内细胞的部分活性和功能的优点，能够在实验室推广使用。

3.2 镉损伤肝细胞体外模型的建立

MTT法是目前检测细胞存活率最为常用的方法，具有快捷简便的优点[14-17]。其作用原理：活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶能将外源性的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，故结晶量与活细胞数成正比。加入DMSO溶解蓝紫色结晶，通过比色测定即可推算活细胞的数量。由于影响MTT结果的因素很多，导致结果不够准确[14，17]。因此，在接种时细胞一定要混匀，加样量一致，多做几次重复，保证所测结果精准，减小误差。

该试验采用MTT法测定镉对肝细胞存活率的影响，结果显示，肝细胞培养24 h后，随着镉剂量的增加，细胞的相对存活率降低，当醋酸镉浓度为4.0 μmol/L，与对照组相比细胞存活率极显著降低（P

在此研究的基础上，肝细胞体外培养4、7、10、24 h时，分别添加4.0 μmol/L醋酸镉处理3 h，采用MTT法检测细胞的存活率。研究发现，肝细胞体外培养7、10、24 h的对照组之间细胞存活率没有显著差异性，且均极显著低于低于4 h对照组，说明肝细胞培养4 h时并未完全贴壁，细胞状态还不稳定，而细胞培养到7 h后已处于稳定状态，可用于后续试验。7、10、24 h镉处理组与同时间对照组相比较，细胞存活率均极显著降低（P

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