奥沙利铂耐药相关机制研究进展

[摘 要] 奥沙利铂已广泛用于临床肿瘤化疗，肿瘤细胞内固有性或获得性耐药是奥沙利铂治疗失败的主要原因。研究奥沙利铂耐药的分子机制对规避、改善这种现象以及优化治疗方案非常重要。目前已发现的奥沙利铂相关的肿瘤耐药机制包括转运、解毒、DNA损伤反应以及修复等，文章综述铜转运蛋白、膜转运蛋白超家族、ABC转运蛋白、谷胱甘肽系统以及奥沙利铂诱导-DNA加合物的修复，进一步揭示肿瘤细胞对奥沙利铂耐药的分子过程，寻找针对性的逆转耐药策略。

[关键词] 奥沙利铂；耐药；分子机制；DNA修复

中图分类号：R730.53 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）03-001-04

DOI：10.11876/mimt201603001

奥沙利铂（Oxaplatin，OXA）是第3代铂类药物，目前用于大肠癌、胃癌和胰腺癌治疗，卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等其他癌症已进入临床试验。OXA在2000年开始用于治疗转移性结直肠癌，它不仅提高了客观缓解率和结直肠来源转移肿瘤（主要是肝转移）切除率，还延长了总生存期（OS），而顺铂和卡铂等其他铂类药物已被证实治疗转移性结直肠癌无效。OXA联合5-氟尿嘧啶（5-FU）治疗方案相比5-FU单药治疗方案，客观缓解率由15%增加至50%[1]。过去十余年，得益于此组合，大肠癌疗效得到显著改善，其中位生存期增加至24个月[1]，四分之一患者无病复发时间超过10年。转移性结直肠癌患者经过OXA化疗后成功切除转移灶。然而，肿瘤固有性或获得性耐药仍可对抗OXA杀伤效果。因此，阐明OXA耐药机制并寻找有效针对性逆转耐药策略具有积极意义。本文将阐述OXA耐药性分子作用机制，包括其在细胞内运输和解毒、DNA修复机制改变、表观遗传学改变以及细胞死亡机制。

1 OXA作用机制

奥沙利铂（左旋反式二氨环己烷草酸铂）是铂类化疗药物家庭中一员。其中央铂原子被一草酸和 1，2-二氨基环己烷包围。这种结构差异使OXA与其他铂类药物相比具有不同活性，能够激活不同细胞损伤识别机制[2]。它是一种静脉滴注化疗药物，其药学动力学特点是：初始阶段药物分布所需时间短，药物排泄主要通过肾脏，一般给药后48h达到完全清除，此药主要剂量限制性毒性是末梢神经毒性。OXA进入细胞后可以与亲核分子（主要是DNA，也有RNA和蛋白质）结合。作为一个DNA交联剂，OXA可以将DNA作为靶点，铂原子与DNA链上鸟嘌呤（G）共价结合，形成链内交链、链间交链，从而干扰DNA复制以及转录。与顺铂相比，OXA结构比较大，所以相同质量OXA分子数比顺铂更少，但是OXA却可表现出更高细胞毒性，这可能与其特有化学结构相关。1，2-二氨基环己烷-铂配合物存在3种同分异构体，这3种同分异构体与DNA相互作用方式不同。核苷酸切除修复（NER）是OXA诱导DNA损伤修复主要途径。

2 OXA出胞入胞及其解毒作用

通常认为铂类药物是通过被动转运进入细胞，但在过去几年中越来越多证据表明协同转运或主动运输在OXA转运过程中起着重要作用[3]。与OXA耐药相关最重要的细胞转运和解毒系统如下。

2.1 铜转运蛋白

研究证实铜出胞和入胞转运蛋白在铂类药物累积过程中起重要作用[4]。虽然人类铜转运蛋白1（hCTR1）参与细胞对OXA吸收过程，但其抗吸收耐药作用机理尚不清楚。实验报道，hCTR1负转录调控因子可导致顺铂和卡铂耐药，但却对OXA敏感性无显著影响。这表明可能其他转运方式参与了细胞对OXA摄取过程，同时也提示OXA拥有不同活性位点。两种细胞内P型ATP酶（ATP7A and ATP7B）参与隔离和排出铜，这两种酶也被证实在铂类耐药中起着重要作用。Howells团队报道ATP7A和B能够隔离细胞内顺铂、卡铂和OXA，使其无法与细胞内DNA或蛋白等靶点相结合，从而限制其细胞毒性[5]。但ATP7A酶与铂类药物结合后却不能进一步将药物通过细胞膜转运至胞外，这一点与铜转运出细胞过程有明显区别。此外，缺乏铜转运蛋白细胞能抵抗顺铂和卡铂毒性作用，但缺乏转运蛋白细胞对OXA敏感性反而更高。在缺乏铜转运蛋白细胞中OXA暴露后细胞内铂-DNA加合物水平明显增加，但在顺铂或卡铂暴露细胞中却没有出现同样现象。近日，同一组文献报道：Sec61β和Sec61蛋白易位通过ATP7A酶负转录调控及其分布影响铂类药物毒性，但不影响其他铜转运蛋白如hCTR1，hCTR2，ATP7B或抗氧化剂铜分子伴侣[5]。根据我们的经验，对OXA获得性耐药常常伴随着对铜交互抵抗和对hCTR1表达负调控。当亲本和OXA获得性耐药细胞株接触到OXA时，只在敏感细胞周围观察到了ATP7A酶显著上调。虽然在临床前或体外水平方面存在广泛参考文献，但是OXA治疗病人中，铜转运蛋白临床影响数据却非常有限。我们研究了使用OXA一线化疗方案大肠癌肿瘤患者ATP7A酶和ATP7B酶的表达水平，发现低水平ATP7B酶化疗效果更好。由于缺乏更大量临床实验研究，检测铜转运蛋白水平很难成为OXA耐药性标记检测标准。

2.2 膜转运蛋白载体超家族

溶质载体（the solute carrier， SLC）转运蛋白在肠、肝、肾生理吸收和/或排泄药物中发挥作用。人类SLC22参与不同物质解毒作用。其中，有机阳离子转运蛋白（organic cation tranporters， OCT）家族参与铂类药物运输，它包括SLC22A1（OCT1），SLC22A2（OCT2）和SLC22A3（OCT3）3类，OCT2表达水平对顺铂和OXA吸收和细胞毒性呈明显正相关。稳定表达hSLC22A2基因（OCT2）、人类胚胎（HEK）293细胞对OXA比较敏感，在较小程度上对顺铂也敏感[6]。然而，人类卵巢癌研究中仅15%病例发现这种转运蛋白阳性表达，并没有统计学意义。值得注意的是在人类9种大肠癌细胞株中并未检测到OCT2mRNA表达[6]。因此，虽然在卵巢癌细胞体外实验中，这种转运蛋白似乎能够将OXA转运至细胞中，但是其在卵巢癌中低表达表明临床标本与细胞实验相关性有限。文献报道其在人类大肠癌中阳性率50% [7]，表明仍需进一步临床研究验证其作为肿瘤相关有效性预测指标价值。

2.3 ABC转运蛋白

目前，超过80%化疗药物主要通过药物外排转运体ABC家族排出到肿瘤细胞外。ABCC亚科包括多药耐药相关蛋白（MRP）参与铂类药物耐药。卵巢癌体外模型证实MRP1和MRP4参与OXA耐药，这些转运蛋白表达增加和N-连接糖基化改变，增强了对OXA耐药性[8]。OXA耐药性与ABCB1（MDR1）表达之间关系研究结果没有显示出令人信服结果。虽然Ekblad等在体外实验中模拟了过表达MDR1使细胞产生对OXA获得性耐药，但是与亲本系对照组相比，在OXA耐药细胞中ABCB1转运蛋白功能并没有明显增加[9]。Lee等报道，人结直肠癌细胞株和临床样本中这些转运蛋白和OXA敏感性之间没有相关性[10]。除了ABC转运蛋白外，在体外和Na/K-ATP酶独立活性条件下，已发现Na/K-ATP酶（β1）亚基低表达和OXA耐性药相关。细胞主要通过Na/K-ATP酶排取Na，Na不仅使细胞内保持离子稳态，而且对维持上皮细胞极化状态至关重要。

3 谷胱甘肽系统

肿瘤细胞对铂类药物耐药一个重要机制是谷胱甘肽（GSH）介导药物外排使细胞内铂类药物含量下降，谷胱甘肽由ABCC载体蛋白质家族调节。OXA一旦到达细胞质就变成水合物，有利于其与含有金属硫蛋白等含巯基分子如谷胱甘肽等进行反应。体外实验研究谷胱甘肽表达水平及活性与OXA耐药相关性时得出了相互矛盾结果：Arnoud S认为谷胱甘肽活性和铂细胞毒性不相关[11]；而张等认为高表达谷胱甘肽降低了奥沙利铂细胞毒性，他们在研究慢性淋巴细胞白血病（CLL）时发现，CLL细胞内GSH含量与OXA耐药呈正相关，而CLL合成GSH主要原料半胱氨酸则来源于骨髓基质细胞释放到肿瘤微环境中，并被CLL细胞摄取利用[12]。

谷胱甘肽S-转移酶（GST）催化GSH与有毒性和致癌性亲电基团结合从而保护细胞中大分子免受损伤。GST超家族不同亚型（α，μ，π，θ，Zeta）中，GSTPi直接参与顺铂解毒，GSTπ亚型在结肠癌和耐药肿瘤中高表达，GSTπ水平是人体对顺铂固有和获得性耐药重要决定因素，但却缺乏其参与OXA解毒作用证据。Tozawa等证明在OXA治疗非小细胞肺癌移植瘤模型（NSCLC）中GSTπ水平增加，GSTPi升高与顺铂耐药性有关，对顺铂耐药胃癌细胞株却对OXA敏感[13]。但Arnould和Pendyala研究结果却提示GST活性和OXA细胞毒性之间缺乏相关性[11，14]。尽管有争议，许多杂志还是报道了GSTπ基因变异和OXA化疗之间影响。具体来说，已证实该基因多态性会影响该蛋白与不同细胞毒药物结合能力进而影响酶活性，随之影响肿瘤细胞化疗作用。因此，OXA为基础化疗方案用于术后辅助化疗、转移结直肠癌和胃癌，该Val/Val基因型（降低酶活性）与获得更好OS相关[15]，虽然也有相反结果文章发表[16-17]，但目前大多数研究人员仍然认为GSTπ可能导致OXA耐药。相反结果可能与研究设计差异有关，如有研究在一线化疗方案中使用OXA[16]，有研究在二线方案中使用OXA[17]；其他因素如样本大小等可能也是导致结果差异原因，因此需大样本、多中心、前瞻性临床试验来验证这些数据。

4 OXA-DNA加合物修复

DNA加合物形成是铂类化合物发挥抗癌活性必不可少的部分。因此，加合物识别和/或修复分子机制在决定它们抗癌活性方面起着重要作用。错配修复系统（MMR）可以完成顺铂-DNA加合物识别及修复，但对OXA-DNA加合物并不起作用。正是由于这个原因，有MMR缺陷肿瘤对顺铂固有耐药，却对OXA敏感。结直肠癌患者常存在MMR系统功能缺失，但OXA针对此类病例仍然有效，顺铂或卡铂则无效[18]。

NER系统在体外试验中被证明能够修复顺铂和OXA所诱导DNA损伤。NER一个最重要介质：切除修复交叉互补组1（ERCC1）和它的催化伴侣XPF（xeroderma pygmentosum group F，ERCC4）参与OXA耐药。体外模型实验证实，内源性ERCC1低水平表达或者敲除沉默都使细胞对OXA更为敏感[19]。近期文献报道，在用OXA治疗后ERCC1反应性表达上调依赖于KRAS调控，KRAS突变细胞不能上调ERCC1表达导致对药物敏感性增加[20]。NER系统中其他蛋白质如XPF，XPG（xeroderma pygmentosum groupG，ERCC5）亦与OXA耐药性相关。因此，在OXA处理细胞中，用siRNA介导这些基因沉默降低了DNA修复效率，使得其对OXA更敏感[21]。也有报道与此结论相悖：stordaland等认为ERCC1表达下降与OXA诱导细胞周期阻滞相关，而与耐药或改变DNA修复能力无关[22]。在OXA获得性耐药体外模型中，发现部分细胞能够上调XPD（xeroderma pygmentosum group D，ERCC2）和ERCC1基因表达，而相同遗传背景OXA耐药细胞株却未出现上述基因表达上调。一些临床研究报道ERCC1基因肿瘤表达水平和OXA治疗效果之间具有相关性[23]。在ERCC1阳性Ⅲ期结直肠癌患者中使用OXA，其5年DFS和OS更短[24]。虽然临床和临床前数据显示ERCC1表达与OXA治疗存在相关性，但仍需要大样本和前瞻性研究证实ERCC1基因表达水平与OXA治疗相关性。

研究证实，包括OXA在内铂类化疗药物能够诱导自由基产生，导致氧化性DNA损伤。碱基切除修复系统（BER）是DNA修复主要途径，它负责清除错配DNA碱基以及修复单链断裂DNA，改变BER活性将会影响铂类药物化疗效果。因此，Preston等证实OGG1（羟基鸟嘌呤糖苷酶1）异常表达或与其功能相同的同源基因大肠杆菌甲酰胺基嘧啶糖苷酶（FPG）异常表达，可激活氧（ROS）引发剂来降低铂类药物导致细胞死亡[25]。

另一个假定OXA耐药机制是通过DNA聚合酶β，γ，η诱导OXA-DNA加合物。例如，在结肠癌和胃癌细胞株中，BER DNA聚合酶中Polβ或Polγ过表达和OXA耐药性呈正相关[26]。在使用包括OXA在内不同铂类药物后，观察到REV1和Polζ能够促进跨损伤DNA合成及DNA损伤修复[27]。

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