HPLC法测定清热解毒口服液中木犀草苷的含量

[摘 要]清热解毒口服液是常见的清热解毒药物，药物成分非常多，木犀草苷就是其中一种。本文应用HPLC法来测定清热解毒口服液中木犀草苷的含量，不仅具有非常好的回收率，而且拥有比较好的内线性关系，还非常简单，准确。希望能够为广大的清热解毒口服液研究者提供借鉴。

[关键词]HPLC法；清热解毒口服液；木犀草苷；含量测定

中图分类号：TU366 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）04-0337-01

清热解毒口服液主要用于治疗发热面赤、咽喉肿痛等病症。很多学者都对清热解毒口服液中的黄芩苷等含量测定方法进行了研究，但是却很少有学者对其木犀草苷的含量进行测定研究，基于此本文研究者选择使用HPLC法来对清热解毒口服液中木犀草苷的含量进行研究。中药药典明确规定金银花以及山银花是两个药材，同时规定木犀草苷含量测定属于金银花项目下的一项测定内容。为了保证清热解毒口服液产品质量，所选择的制剂以及药材必须能够一一对应。所使用的HPLC法测定法，方便、准确，具有非常好的重现性，因为可以用来对控制清热解毒口服液的质量。

一、仪器与试药

戴安Ultimate3000高效液相色谱仪：紫外检测器，四元泵，自动进样器；瑞士PrecisaXR205SM-DR电子分析天平。木犀草苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号111720-200604）；清热解毒口服液为市售不同厂家的产品；水为高纯水，乙腈、冰醋酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。聚酰胺，柱层析用，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂。金银花药材为药材市场购买，河南省食品药品检验所鉴定。

二、溶液制备

1、对照品溶液

精密称取经五氧化二磷减压干燥12h的木犀草苷对照品适量，用70%乙醇制成36.6μg・mL-1的对照品溶液。

2、供试品溶液

精密量取清热解毒口服液25mL，加水25mL稀释后全部上聚酰胺柱（玻璃柱，自行填装，规格长29cm，内径1.1cm），先后用水、10%乙醇、20%乙醇各200mL洗涤除杂，再用35%乙醇200mL洗涤，收集该洗脱液，水浴挥干，用甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，即得。

3、阴性样品溶液

取不含金银花的处方比例药材，按照清热解毒口服液生产工艺，制备阴性样品。按清热解毒口服液的供试品溶液的制备方法操作，即得。

三、结果

1、色谱条件及系统适用性试验

采用Agilent ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以0.2%磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱（0～30min，87%A、80%A；30～38min，80%A、63%A；38～40min，63%A；40～41min，63%A、87%A；41～60min，87%A），流速1.0mL・min-1，检测波长350nm，柱温30℃，进样量10μL。以木犀草苷色谱峰计理论塔板数应不低于2000。用上述色谱条件分别对对照品溶液和清热解毒口服液的供试品溶液进行分析，结果木犀草苷主峰与其他色谱峰分离良好，辅料和其他药材不干扰测定。同时用缺金银花的阴性样品进行分析，在与对照品主峰相应的保留时间处未出现色谱峰，说明本法具有较强的专属性。从清热解毒口服液样品的HPLC-PDA图中可以看出，木犀草苷的最大吸收波长为350nm，峰纯度0.995，提示其为单一峰；质谱检测[仪器：Waters公司ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，Quattro Premier串联质谱检测器。色谱条件：采用Waters公司ACQUITY UPLCTM BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）色谱柱，流动相为10mmol・L-1醋酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈（75∶25），流速0.13mL・min-1。质谱条件：离子化方式，电喷雾（ESI）；离子极性，negative（-）；扫描范围：50～1000；工作参数： Capillary（kV）3.50；Extrac-tor（V）4.00；SourceTemperature（℃）110；Desolva-tionTemperature（℃）350；ConeGasFlow（L・h-1）46；DesolvationGasFlow（L・h-1）500；GasCellPira-niPressure（Pa）0.3；

检测方式：全扫描，结果显示其母离子[M-1]的m/z为446.90，与木犀草苷相对分子质量448一致，子离子[M-1]的m/z为285.10，木犀草苷脱去糖苷后的质量数为286，与检测到的子离子一致，说明检测到的成分是木犀草苷。

2、线性关系考察

精密量取上述对照品溶液1，2，3，5，10μL，分别按上述色谱条件进行测定，以木犀草苷进样量（ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为：

A=45.04C-0.078r=0.9999

3、精密度试验结果

研究者取相同批次溶液，之后进行不间断的进样，共6次，结果显示木犀草苷峰面积达到了1.4%，这足以证明进样具有非常好的精度。

4、重复性试验结果

研究者首先选择相同批次的清热解毒口服液样品，共量取5份，测定样品，结果显示这5份样品溶液中，木犀草苷的平均含量为4.2μg.ml-1，木犀草苷峰面积达到了1.9%，这足以证明高效液相色谱法具有非常好的重现性。

5、稳定性试验结果

研究者首先选择相同批次的清热解毒口服液样品，共量取5份，测定样品，测定时间分别为0h、4h、8h、12h、20h、24h，最终显示木犀草苷峰面积达到了1.3%，这足以证明清热解毒口服液样品中的木犀草苷在24h保持着比较稳定的状态。

6、加样回收率试验结果

精密量取已知木犀草苷含量（4.19μg・mL-1）的清热解毒口服液样品12.5mL，共6份，每份精密加入木犀草苷对照品溶液（36.6μg・mL-1）1mL，按上述方法制备所需溶液，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率。结果木犀草苷的平均回收率（n= 6）为99.8%，RSD为3.4%。

7、样品测定结果

取不同厂家的清热解毒口服液，按上述方法制备供试品溶液，在色谱条件下进样测定，用外标法计算含量，结果见表1。

四、结论

首先，测定之前的方法选择。因为热解毒口服液构成成分比较复杂，共有12味中草药材，这些药材再通过多道加工程序才获得，成分非常复杂，因此会对HPLC法造成比较大的干扰，不能够直接进样。这样不仅会对色谱柱造成非常大的污染，也会导致色谱峰叠加，出现明显的分离情况。研究者使用了不同种类的填料进行除杂试验，结果发现聚酰胺柱具有非常好的除杂效果。研究者不同种类的洗脱溶剂进行了除杂试验研究，结果表明本文所应用的洗脱溶剂效果的确非常好。

其次，对检测波长进行选择。研究者取木犀草苷对照品溶液，使用紫外分光光度展开扫描，扫描范围为200-400nm，最终波长在350nm吸收效果最好。研究者又借助液相色谱仪进行测定，溶液的确是在350nm处拥有最佳的吸收率。所以研究者决定将350nm看作是检测波长。

最后，流动相的选择。因为清热解毒口服液成分比较多，也比较复杂，所以研究者选择使用了多种流动相系统以及多种梯度洗脱程序来进行试验研究，结果显示此次研究所选择应用的AgilentZorbaxSB C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以0.2%磷酸（A）-乙腈（B）为流动相流动相效果最佳，具有非常好的分离效果，分离度也达到了标准要求。

综上研究可以发现，清热解毒口服液生产厂家不同，所使用的药材不同，生产过程中所使用的工艺不同，导致了中木犀草苷的含量的差异，为了保证中清热解毒口服液拥有比较好质量，可以选择使用本文使用的测定方法。

参考文献

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