强脉冲光不同脉宽对豚鼠皮肤色素和表皮黑素细胞影响的实验观察

[摘要]目的：评价强脉冲光不同脉宽对豚鼠皮肤色素及表皮黑素细胞的影响。 方法：用三种脉宽分别照射三组豚鼠，分不同阶段取材，观察皮肤色素及表皮黑素细胞的变化。 结果：对每次照射后的色素变化作统计学比较，发现高脉宽的能量组去除色素效果优于另外两组（P＜0.05）,并且透射电镜观察该组黑素细胞的细胞器变性明显，但细胞核和细胞膜完整。 讨论：强脉冲光的较长脉宽，可以使较高能量治疗的安全性提高，效果优于短脉宽。

[关键词]强脉冲光；脉宽；色素；黑素细胞；

[中图分类号]R318.51Q251[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-04

Effects of three kinds of pulses width from IPL on skin melanin and epidermal melanocytes of guinea pigs

XU Fang,LI Da-tie,YANG Ning

(Aesthetic Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi 563003,Guizhou,China)

Abstract: ObjectiveTo evaluate the effects of different pulses width from IPL on skin melanin and epidermal melanocytes of guinea pigs. Methods Three kinds of pulses width were used on the skin of guinea pigs. Multiple biopsies were taken in different stages, and through light microscopic and transmission electron microscopic we observe the variation of skin melanin and epidermal melanocytes. ResultsThe effect of the longer pulse is more superiority than the others（P

Key words: IPL; pulses width; melanin; melanocyte

为探求不同脉宽IPL对皮肤色素的影响，笔者以相同波长、不同脉宽的强脉冲光对豚鼠皮肤进行照射，并观察不同时期豚鼠皮肤色素及表皮黑素细胞的变化，试图进一步了解脉宽与皮肤色素的影响关系，特作以下研究报道。

1材料和方法

1.1实验动物：健康雄性棕色豚鼠10只(第三军医大学实验动物中心提供，普通级)，体重0.35～0.45kg，平均0.40kg，鼠龄4月。

1.2主要仪器：紫色兰朵光子嫩肤仪(PLASMALITE，瑞典医学生物有限公司提供)，光谱范围535～920nm；光斑10mm×20mm；脉宽1～100ms可调；能量密度最大50J/cm2，与脉宽自动同步调节。光学显微镜(OLYMPUS)，电子显微镜(JEX-1200，PHILIPS公司)。

1.3动物分组：将豚鼠随机平均分为3组，每只实验动物背部取3个大小为3cm×3cm的皮区，皮区间相距3cm。每个皮区的肤色及皮肤厚度基本一致，其为强脉冲光照射区，每组10个皮区。

1.4强脉冲光照射：在照射前，用弯剪剪除豚鼠背部长毛，电动剃须刀剃净短毛，并且均匀涂抹冷凝胶约2mm厚。用535nm滤光片，脉宽分别用临床常用的36.5ms（能量28J/cm2）、脉宽39.8ms（能量30J/cm2）、脉宽46.2ms（能量34J/cm2）的强脉冲光进行照射，因为太高的能量副作用比较大，太低的能量治疗效果不理想。照射时光导头紧贴冷凝胶，但不可压紧皮肤。光斑不重复，不漏照，操作者要戴防护眼镜。各组同时照射，每隔一月照射一次，共照射三次。

1.5取材：每组每个照射区域分别于第一次照射前，照射后5min、1周、1月、2月（第三次照射前）、3月（第三次照射后1月）取电镜及光镜标本送检。其中第一次照射前的取材为正常对照。电镜标本大小为1mm×1mm，取材后迅速2.5%戊二醛4℃下固定；光镜标本大小为0.5cm×0.5cm，迅速用20%福尔马林常温固定。

1.6电镜标本的制作与观察：用2.5%戊二醛固定标本，保存在4℃下，送第三军医大学电镜中心制成电镜标本。标本于4℃冰箱内固定24h，常规脱水，包埋，超薄切片(500～1000A)，双铅染色。将电镜标本置于JEX－1200透射电镜下观察细胞超微结构并摄片。

1.7光镜标本的制作与黑素含量指数的测定：常规石蜡切片HE染色，Lillie亚铁反应法染色。使用多媒体病理图像分析系统对Lillie亚铁反应法染色切片进行黑素含量指数(melanin content index，MCI)的测定，计数并摄片。MCI－I：随机选择10个基底层含黑素颗粒细胞，测定黑素颗粒面积占细胞总面积的百分比，取平均值；MCI－2：选择10处表皮，测定受检基底层和棘细胞层内黑素颗粒的面积占该处表皮基底层和棘层总面积的百分比，取平均值。

1.8统计学方法：采用成组t检验，使用SPSS l2.0软件作数据处理及分析，检验水准α＝0.05，P＜0.05为有差异，P＜0.01为有显著性差异。

2结果

2.1照射前：豚鼠背部强脉冲荧光照射区剃光毛后见肤色呈棕黑色，光镜可见基底层黑素颗粒分布广泛，密度较高，有的甚至达棘层，其MCI-I(x±s)分别是为MCI-1：38.2±6.7；MCI-2：9.0±5.3。电镜可见黑素细胞呈钝圆或不规则形，胞核大，胞浆丰富，胞核旁富含I、II期黑素小体，胞浆周边可见较多已黑素化的III、IV期黑素小体（图1）。

2.2照射后5min：直接观察照射区可见豚鼠肤色有加深，以46.2ms组明显，且组织略有肿胀。光镜下可见黑素颗粒崩解较明显，部分向上进入棘层及以上皮肤各层，少量进入真皮层。电镜下黑素细胞的细胞膜以及细胞核完整，黑素小体部分中央出现空泡化，有的崩解为更细小的颗粒，少部分线粒体及高尔基体肿胀明显（图2）。统计MCI，结果显示：以46.2ms组明显，经统计学分析有差异（P＜0.05）。见表1。

2.3 第一次照射后1周：直接观察照射区可见肤色有所减退。光镜下可见各组的黑素颗粒有所减小，空泡化的基底细胞在原有轮廓的基础上出现修复倾向。电镜下大部分黑素小体进一步空泡化，黑素细胞部分线粒体肿胀明显，有的内部嵴断裂，内质网及高尔基体亦有破坏（图3）。统计MCI，结果显示：以46.2ms组明显，经统计学分析有差异（P＜0.05）。见表2。

2.4第一次照射后1月(第二次照射前)：直接观察照射区域见肤色减退，46.2ms组较明显。光镜下各组黑素颗粒逐步减少，含泡化的基底细胞修复明显。电镜下可见黑素细胞核周边有I、II期黑素小体，III、IV期已明显减少，部分线粒体等细胞器变性（图4）。统计MCI，结果显示：以46.2ms组明显，经统计学分析有差异（P＜0.05）。见表3。

2.5第二次照射后1月(第一次照射后2月，第三次照射前)：直接观察照射区可见肤色进一步变浅，46.2ms组较明显，39.8ms组次之。光镜下观察各组的黑素颗粒进一步减少，基底层细胞完整，移至棘层以上的粉末状黑素颗粒消退明显。电镜下黑素细胞核周边III、IV期黑素颗粒残留较少，I、II期黑素颗粒仍可找到，线粒体及高尔基体变性明显部分完全破坏（图5）。统计MCI，结果显示：以46.2ms组明显，经统计学分析有差异（P＜0.05）。见表4。

2.6第三次照射后1月(第一次照射后3月)：直接观察照射区可见肤色明显变浅，46.2ms尤为突出，39.8ms组次之。光镜下观察各组的黑素颗粒明显减少。电镜下黑素细胞核周边有少量I、II期黑素小体，III、IV期已很难找到，部分线粒体等细胞器变性较明显。但各组黑素细胞的细胞膜、细胞核完整（图6）。统计MCI，结果显示：以46.2ms组明显，经统计学分析有差异（P＜0.05）。见表5。

3讨论

美国加利福尼亚的Patrick Bitter Sr博士于1998年首先报道了光子嫩肤技术(Photo rejuvenation)[1]，并定义为使用连续波长的强脉冲光子在低能量密度下的非剥脱性非侵入性嫩肤治疗。

强脉冲光本质上属于非相干光，仍属于普通光而不是激光，是一组波长为400nm～1 200nm的适合皮肤疾患治疗的强光混合波[2]。具有高能量的、波长相对集中、脉宽可调的强光在治疗参数上与激光相类似，同样可达到选择性光热作用原理进行治疗，所以在临床上强脉冲光源被认同为与激光相似的治疗技术。输出的光波中较短波长的光因其处于黑色素的吸收峰，故可被皮肤中的色素优先选择吸收，达到治疗作用[3]。

现代Q开关激光治疗色素性病变时，激光脉宽极短，短至几～几百纳秒（1ns＝10-9s），而峰值功率相当高。可使色素颗粒骤然受热而发生瞬间爆破，色素颗粒骤然受热而发生瞬间爆破，使色素团或色素细胞破坏、分解，从而达到治疗色素斑的效果。由于激光的脉宽小于色素颗粒的热弛豫时间，因此治疗中不会损伤周围正常组织，细胞框架可被完整地保留下来。而被清除了色素颗粒的细胞，可在较完整的细胞框架的基础上，得到修复[4]。

但是强脉冲光的脉宽比较长，为几～几百毫秒（1ms＝10-3s）连续可调，已经超过了色素颗粒的热弛豫时间，治疗中可能影响周围正常组织。但是，强脉冲光峰值功率相对要低，而且能量分布在不同波长的光中，所以可以改善包括不规则色沉、皮肤纹理和毛细血管扩张在内的所有的光老化现象，达到嫩肤的治疗目的。且每次击发可选择1～3个脉冲，脉冲方式释放能量可使靶组织持续升温，而让表皮充分散热，以保证安全，因而无副作用比较小。

强脉冲光对于皮肤组织的作用与透射深度和组织颜色有一定的关系。决定透射深度的主要是波长，脉宽和能量与光的透射深度无关，但会影响能量分布。

实验中，我们无论从大体标本观察皮肤色素改变，以及光镜、电镜微观观察皮肤黑色颗粒的变化，并作统计学比较，均发现脉宽46.2ms（能量34J/cm2）组去除色素效果优于另外两组。但三组的作用深度基本一致，未见真皮层色素的变化。能量越大在被黑色颗粒吸收后，其转型为热能就越多，使导致黑色颗粒发生的“选择性热解作用”的机率就越大，从而导致了较好的去除色素的效果。可以认为在安全的前提下，剂量越大，效果越明显[5]。

但在实验中我们也观察到，在能量加大的同时，周围正常组织受到损伤的机率亦会加大。脉宽46.2ms（能量34J/cm2）组中个别未被及照射的黑素颗粒出现空泡化，但电镜中观察其线粒体及高尔基体等细胞器未见变性。这主要是因为照射部位冷凝胶起到了保护的作用。在脉宽36.5ms（能量28J/cm2）、脉宽39.8ms（能量30J/cm2）组中未见相类似的变化，周围未被照射区在照射前后无明显直观及光镜、电镜下变化。究其原因主要是光能量在组织内聚集越大，损伤就越大[6]。

实验中可见随着照射次数的增加，豚鼠肤色的逐渐变浅，相同能量对同一照射区的作用效果逐渐变小，所以可以推测深色皮肤吸收光的能量明显优于浅色皮肤。因此我们在正式治疗前应在耳前区进行光斑试验，确定治疗需要的最佳能量，并且随着治疗次数的增加应适当提高能量[7]。

强脉冲光对色素产生热效应，同时也对病灶周围的其它组织产生热效应。特别是用高能量治疗时对周围组织损伤的机率加大。所以，在照射前要在照射部位皮肤上涂冷凝胶[8]，这样可以降低皮肤温度，从而对周围正常组织的热损伤可以降到最低。

在脉冲能量不变时，峰值功率和平均功率与脉宽成反比。因此脉宽愈短，强脉冲光对组织作用的峰值功率就愈强，对组织的损伤愈大。调长脉宽，就可以降低峰值功率，使能量释放的时间加长，避免组织局部能量迅速积聚，减少副作用，增加安全性[9]。

而紫色兰朵达到最高能量时其脉宽同时加大，因此对组织的损伤大大降。但是在实际工作中我们发现，其参数可能是针对欧美白人设置的，对于黄种人仍然显得偏高。所以现在新的强脉冲光设备一般都是能量与脉宽随意可调了，便于根据患者情况具体调整。

[参考文献]

[1]Bitter PH. Noninvasive rejuvenation of photo damaged skin using serial, full-face in tense pulsed light treatments[J].Dermatol Surg,2000,26(9):835-842.

[2]孙林潮,高天文,和 娟,等.强光治疗及光子嫩肤[J].中国美容医学，2004,13（1）：114-116.

[3]Anderson RR. Parish JA. Selective photothermolysis: Precise microsurgery by selective aborption of pulsed irriation [J]. Science, 1983,220（4596）:524-527.

[4]周展超,吴余乐.皮肤美容激光[M].南京：东南大学出版社,2000,112-117.

[5]杨 宁,李大铁,谷 琪,等.不同能量的光子嫩肤对豚鼠皮肤黑素及含量的影响[J].中国激光医学杂志，2005，14（3）：179-185.

[6]高景恒,白伶珉,李孟倩.强脉冲光在美容外科应用的文献复习[J].实用美容整形外科杂志，2003,14（1）：39-43.

[7]Coriene Hannapel.Full-face intense pulsed light treatment battles photoaging [J]. Cosmatic surgery Times, 2000,3(6):252.

[8]Negishi K,Wakamatsu S,Kushikata N,et al.Full-face phtorejurenation of photodamaged by intense pulsed light with tegrated contacr cooling: initial experiences in Asian patients [J]. Lasers Surg Med, 2002,30(4):298.

[9]Coriene Hannapel.Full-Face intense pulsed light treatment battles photoaging[J]. Cosmetic Surgery Times,2000，3(6):252.

[收稿日期]2007-11-21 [修回日期]2008-03-02

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”