规范ELISA操作标准 保证检验质量

2019-10-15 版权声明 举报文章

摘要:目的:了解影响ELISA方法的因素;方法:对ELISA方法操作的程序及结果进行分析;结果:影响ELISA结果的常见因素有加样,反应时间,洗涤等;结论:ELISA方法具有简单准确快速经济实用等特点,具有很好的临床应用价值。

Abstract: Objective: To understand the factors that affect the ELISA method; Methods: To analyze the procedures and result of ELISA method; Results: The common factors that affect the result of ELISA include sample, reaction time and washing. Conclusion: ELISA method is simple, accurate, rapid and practical, with a good clinical value.

关键词:ELISA;试剂;操作

Key words: ELISA;reagent;operating

中图分类号:R446 文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)28-0238-02

0引言

ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括洗涤用水,应为新鲜和高质量的纯水。要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm.

1ELISA操作标准

1.1 标本的采取和保存大部分ELISA监测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时监测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。一般说来,在5d内测定的血清标本可放置于4℃.标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需-20℃.保存。冻结血清溶解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀并避免产生气泡。浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再监测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次监测,宜少量分装冰存。保存血清自采集就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。

1.2 加样加样时,样品应加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出。

1.3 保温在建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1~2h,产物的生成可达顶峰。为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,反应板不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温度是在空气浴中完成,采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应,边上的值会偏高,建议为了客观的判断结果,将质控放在非边缘位置。

1.4 洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却决定着实验的成败。ELISA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在ELISA操作中,洗涤是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。

洗涤也多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水集团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而消弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%~0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验灵敏度。洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释,应按要求稀释,所用的水电导率最好在1.5us/cm以下,洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40s左右,孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好,手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。

1.5 显色和比色TMB经HRP作用后,约40min显色达高峰,随即逐渐减弱,至2h后即可完全消退至无色。TMB得终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12~24h)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定得波长(450nm)测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪,通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001,准确性为1%,重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15~30℃,使用前先预热仪器15-30min,测读结果更稳定。测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读,即每孔先后测读两次,第一次在最适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次测定间不移动ELISA板的位置,最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指引等造成的光干扰[1]。

2本底及假阳性产生的原因分析

2.1 基因工程抗原与合成肽抗原的区别

2.1.1 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达得蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点:①分子量大。合成肽采用化学方法制备,由于工艺的局限,合成数量有限,只能达到数百个氨基酸;而利用基因工程制备的抗原,分子量更大。②稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证,早期合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3~4个月,采用基因工程抗原后效期大大延长了。③基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达,表达产物包含更多德抗原决定簇,可提高试剂盒德灵敏度,提高检出率。④纯化难度大。基因工程抗原德纯化技术难度较大。

2.1.2 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点:①分子量太小;②一般只含有一个抗原决定簇;③纯度高;④稳定性差。

由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性,ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就HCV ELISA试剂盒来讲,第一代产品为合成肽抗原,主要是HCV特异性抗原决定簇的肽片段;第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽,只是当时的基因工程抗原不全,仅包括了HCV的核心片段;第三代产品基本上采用了基因工程抗原,而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV特异性抗原。第三代试剂的灵敏度也大大提高了。

由于历史的原因,人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒,因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被,该类试剂盒的流行病学敏感度不够,稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度,科学的对待反应结果[2]。

2.2 假阳性本底产生的原因

2.2.1 抗原因素①融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例,因为包被的基因工程抗原为融合蛋白,包含了来自表达载体的一些序列,因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。②错误排序的影响。合成肽在制备过程中,如果某些肽序列错误,会导致合成肽特异性改变而产生不利的影响,但由于基因工程技术的不断进步,由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。③抗原纯度对特异性的影响。以HCV抗原为例,利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱登分离纯化步骤才能最后得到一定纯度的HCV抗原。目前的工艺还不能做到抗原纯度为100%,因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白,受过大肠杆菌感染的人,血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。

2.2.2 人血清中的正常IgG人血清中IgG的浓度对HCV试剂盒有较大的影响。HCV试剂盒采用的间接法,酶标抗抗体能与人所有IgG结合,而IgG吸附于板孔的能力很强,因此我们采用100μm样稀加10μm血清来将其稀释以降低本底,到成人时,据统计学调查,成人IgG为12mg/ml,而有些人的IgG浓度会远远高于此,这部分人的血清经ELISA反应后往往会显色。

2.2.3 人血清中异常的IgG结缔组织病(系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤登)登病症时,血清中的风湿小体和其它异IgG(IgG浓度达到50mg/ml)会引起本底升高或假阳性。

2.2.4 溶血的影响当溶血时,红细胞中的血红蛋白释放到血液中,血红蛋白具有过氧化物酶的性质,当其通过吸附或“PP效应”(蛋白质间相互吸附的现象)结合后,可催化A、B液显色而造成假阳性。

2.2.5 操作不当引起任何操作不当都会影响结果,因此在操作过程中保证操作的规范,严格按照说明书进行是得到准确结果的关键和基础。

2.2.5.1 加样①样品稀释液少加,或血清多加,都会引起本底增高。对于间接法来说,受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多,高于规定的稀释倍数,必将带来阴性高值。②酶结合物的不正确加入。一般来讲,酶也有一定的非特异吸附,将包被好的酶联板再封闭,一方面也可以避免酶的非特异性吸附。通常每孔加入的封闭液为120μl。如果加入的酶多于120μl或加在较高的孔壁上或孔口,也会引起本底升高或假阳性。

2.2.5.2 温育①由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点,升高反应的温度,会加快反应,同样增加时间会延长反应,这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多,也会引起阴性高值或假阳性。②由于试剂盒通常设定的反应温度为37℃,在这个温度下放置30min,蒸发的水分会很多,对于整个反应体系来讲,各种反应物的浓度会不断增加,这样必会导致反应最后的值升高。因此温育时应盖上胶贴。③试剂盒在设计时,反应是在静置条件下完成的,如果反应改变为振动条件,会加快分子的热运动,增加反应的机会。④试剂盒的温育过程是在培养箱中进行,这和水浴的条件不一样。水浴可使酶联板迅速升温,但较难将温度控制在较稳定的温度,往往高于37℃,同样会引起高值阴性。

2.2.5.3 洗板①各个厂家使用的洗液配方是不同的,是根据各自试剂的条件配制的,采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果,包括本底过高。本公司的洗液采用独特的洗涤系统不能和其它公司的试剂盒混用。②试剂盒中提供的洗液是浓缩的,应该稀释到规定的倍数使用,过多稀释洗液,会影响洗液的效果,而使反应的本底过高。③稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水,电导率小于1.2μs。如果水中含有过多的Ca,Ng,这些离子会占用表面活性剂,影响洗涤效果。④洗板时,应每孔加满洗液,如果加入的洗涤液量不够,对洗涤的效果影响也是很大的。本公司的酶联板板孔为400μl,比别家的板孔大,因此洗了别公司的板后要及时调整液量,以避免加液量不满。⑤洗板的次数不够孔内多余的抗原(抗体)或酶结合物不能彻底去除,也会因此本底升高。⑥洗板的强度和洗板的浸泡时间是密切相关的。洗板机不同,使用的泵不同,液体加入时的冲力不同。如果加入洗液的冲力不大,也没有设定浸泡时间,同样会使结果的A值偏高。⑦洗板完毕后,要进行拍板,尽量采用质量好的毛巾和吸水纸,使用易掉渣的纸,纸屑会留在板孔中,由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。

2.2.5.4 显色加A、B液准确,顺序不能颠倒,要及时终止显色。终止后要在3分钟内读数,否则强阳性会变低。

2.2.5.5 枪头、加样槽或其它来源的污染如果使用的枪头、加样槽是反复使用的,必须肯定其么有来自酶或阳性的污染。酶作为反应的催化剂,极其微量也会很明显影响反应。反复使用的枪头、加样槽清洗不当,也会干扰反应。如将枪头使用84消毒液浸泡而没有冲洗干净,因为84是强氧化剂,加入AB液后就会显色。同样枪头和加样槽擦干,但是如果使用的手纸容易掉渣,会将纸上的强氧化剂留在槽中而影响反应。

2.2.5.6 测A值时,微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起A值的升高。

参考文献:

[1]叶应妩,王毓三,申子喻.全国临床检验操作规程[M].南京东南大学出版社,2006:第3版,618-620.

[2]陈宏础.临床生化检验.临床生化检验,2001:235-238.

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