NO、NOS与缺血再灌注损伤的研究进展

关键词： 一氧化氮；一氧化氮合酶；缺血再灌注损伤

摘要 一氧化氮及一氧化氮合酶对缺血再灌注损伤有重要的影响，但有关实验结果的结论却相反，这与各实验观察的动物种类、实验条件及时相点不同有关。有必要作进一步的研究。

关键词　一氧化氮；一氧化氮合酶；缺血再灌注损伤

近年来一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）对缺血再灌注损伤的效应引起人们的广泛关注，本文就其在缺血再灌注过程中的研究现状作一综述。

依赖于NOS的NO生物合成

NOS的分类、分布及调节 NOS分为两类，即原生型NOS（constitutive nOS,cNOS）和诱生型NOS（inducible NOS，iNOS）。对其分子水平研究显示源于内皮细胞和神经原的表达产生基因序列并不一样，但其活性均依赖于钙离子和钙调蛋白，故又将其分为神经原性NOS（ncNOS）和内皮细胞NOS（ecNOS0）。iNOS的生物活性不依赖于钙及钙调蛋白，一般情况不表达。可被一些细胞因子如白介素-1β（IL-1β），肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导激活。虽然三种NOS的基因编码不同，但结构有相似性，因而功能上也存在相似性[1]。

三种NOS除主要分布于胞浆的可溶性成分外，也存在于一些亚细胞器中[2]，不同的组织可有同一种NOS，但同组织内的同种NOS，在不同的状态下可能其功能是不同的。近来发现iNOS并非一定在诱生下才表达活性；大鼠肾小球在静息状态下存在类似于小鼠巨噬细胞的iNOS，而肾内弓形和小叶间动脉则为类似于大鼠血管平滑肌的iNOS，因此肾内iNOS也可调节基础状态下的细胞功能。相反，ecNOS也受运动、缺氧、机械刺激等因素调节；故iNOS和cNOS诱导或自主合成NO是相对的，可能仅仅是刺激因素种类及强度不同而已。

NO的合成及调节 左旋精氨酸（L-Arg）和分子氧作为底物在其限速酶NOS的作用下，生成中间产物对羟基-左旋精氨酸，继续氧化后生成NO，NO激活鸟氨酸环化酶使cGMP水平增高而发挥其生物学效应，这一途径称为L-Arg-NO通道，简称NO通道。合成后的NO半衰期为3-6秒。NOS是NO合成的限速酶，是调节NO的最重要环节。包括NO合成底物、产物的调节，但其作用较弱。cNOS主要由钙离子调节其活性，而iNOS主要由毒素，细胞因子等介导，通过对表达、转录、翻译各环节对其调节进而调节NO的合成量。近来发现iNOS的调节在不同种属间差异很大，如IL-1，TNF不能引导牛巨噬细胞iNOS的表达，但对小鼠则有显著的诱导活性[3]。因此，NOS，NO的调节是一个非常复杂的过程。

NO的生理效应

血管扩张作用　NO使cGMP升高，再经cGMP激活相关蛋白激酶，使血管平滑肌松弛，血管扩张。

抑制血小板聚集与粘附　NO使血小板中cGMP含量升高，导致胞浆游离钙进入亚细胞器而使其浓度降低，从而抑制其聚集粘附[4]。

细胞保护作用 低浓度的NO对细胞具有保护作用，其机制可能是：①经扩张血管而改善细胞灌注及抑制血小板功能，产生抗凝效应。②NO与谷氨酸的巯基结合，经亚硝酰化而形成二硫键而使谷氨酸受体调控离子通道下调，防止细胞内钙超载，另一方面也防止NO+向NO-转变，，从而阻止NO-与超氧阴离子反应而产生的细胞毒性物质。

信号传递作用

NO是小分子脂溶性化合物，易通过细胞膜自由弥散，化学性质活泼，体内广泛存在着以其为递质的神经系统，在信号传递中起着重要作用[5]。

炎症介质作用

在血管内皮细胞、平滑肌细胞及粒细胞中均有NOS存在，在炎症时它可使血管通透性增加，炎细胞、蛋白渗出加剧。

细胞毒性作用　在高浓度状态下（nmol水平），NO对细胞有损伤作用，与超氧阴离子反应生成超氧亚硝酸根离子，后者及其分解产物羟自由基可导致细胞毒性作用。同时还可引起细胞核酸亚硝酰化，破坏DNA结构，形成亚硝酰铁络合物，从而抑制某些细胞呼吸和DNA复制有关的酶活性[6]。

NO、NOS与缺血再灌注损伤

近年来关于NO及NOS对缺血再灌注损伤的研究颇多，但结论不一，现将其主要观点介绍如下。

NO、NOS对缺血再灌注损伤有保护作用 Osei等[7]用镰状细胞性贫血的转基因鼠及正常鼠观察其在缺氧时的变化，基因鼠cNOS表达缺失，在缺血区及其iNOS表达是升高的，正常鼠iNOS表达则不升高且分布无序；组织学检测显示转基因鼠缺血区组织结构的损伤较正常对照鼠明显减轻，提示iNOS对缺血缺氧性损伤有保护作用。另一组研究显示兔心肌缺血再灌注时加用消心痛或NO的底物L-Arg，可减轻缺血灌注时的心律失常及左室末期压和冠状动脉阻力升高，但加用NOS的抑制剂NG-monocethyl-L-arginine(L-NMMA)则使上述改变加剧。Yang等[8]对心肌缺血再灌注鼠用脂多糖诱导其NO升高，结果使冠状动脉阻力和心律失常发生率均降低，缺血心肌细胞得以保护，也证实了这一点。NO可抑制细胞膜钙通道活性，减轻细胞内钙超载，研究显示NO可抑制5-HT介导的肺动脉平滑肌细胞[Ca++]i升高，调节细胞器储存钙的释放，从而使血管舒张[9]。Kannam等[10]用NO供体S-nitroso-N-acetyl-d,L-penicillamine(SNAP）使NO合成增加可抑制气管平滑肌细胞肌浆网钙的释放，从而使[Ca++]i降低。NO可通过cGMP途径消除氧自由基。Yasmin等[11]用缺血再灌注鼠心于缺血前5分钟和再灌注开始5分钟用NO供体SMAP灌注，可使超氧亚硝酸根离子和超氧阴离子明显减少，心功能得以保护。NO可抑制细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达，从而使中性粒细胞的粘附及渗入减轻，组织细胞结构及功能得以保护。

NO、NOS加重心肌缺血再灌注损伤 有研究显示组织缺血再灌注NO、NOS是增高的，且这种增高与缺血再灌注损伤的程度呈正比。Barnard等[12]发现血管内皮细胞释放阴离子，这些氧自由基的产生对组织细胞有明显的致损作用。研究还发现NO可使TNF升高而导致细胞损伤。一组用低剂量NO吸入3周以观察其对鼠肺动脉高压作用的研究结果显示其并不能扩张血管而使肺动脉压降低，也不能预防血管平滑肌增厚[13]。Izomi等[14]用NOS抑制剂7-nitrondazole（7-NI）对海马区缺血鼠进行干预，结果使缺血性损伤得以改善。用ncNOS表达缺失的鼠制造的脑缺血再灌注模型显示其梗塞范围及脑水肿程度均较对照组明显减轻[15]。用NG-nitro-L-arginine methl ester(L-NAME)抑制NO合成可使心肌氧耗量明显降低[16]；而用脂多糖诱导鼠心肌细胞iNOS的表达，使NO合成增加，结果引起心肌的收缩功能降低[17]。这些均支持NOS、NO参与了缺血再灌注损伤。先前研究认为cNOS对缺血再灌注损伤有保护作用，仅iNOS缺血再灌注时激活而产生过量的NO才对组织细胞有害，然而近来大量研究显示cnNOS对缺血再灌注损伤有加剧作用[18]。一组超氧化物岐化酶（SOD）转基因鼠脑缺血再灌注研究显示，当加用cNOS非选择性抑制L-LAMW一起抑制ecNOS及ncNOS时，梗塞范围扩大，而用选择性ncNOS抑制剂7-NI时，则梗塞范围缩小，提示ecNOS对缺血再灌注损伤有保护作用而ncNOS则有害，且SOD对组织细胞的保护机制还包括其对ncNOS的抑制及对ecNOS的促进[18]。

对上述实验结果的巨大的差异目前尚无确切的解释，实验动物种属的差异，缺血及再灌注组织、程度的不同及时间长短的不同必然会导致其结论的差异。检测的时相不同甚至可得出截然相反的结论。在对大鼠心肌缺血20min后再灌注的研究中发现，再灌注开始30s时，心肌的NO、超氮亚硝酸根离子和超氧阴离子是增高的，用NOS抑制剂L-NMMA或SOD均可使这种改变减轻；但于再灌注30min时，却是减少的，组织产生的氧自由基产物可被增加灌注的供体SNAP所抑制并伴随心功能的改善。有研究显示大鼠心肌缺血再灌注NOS损伤时于缺血早期心肌的灌注是增加的，且于再灌注1h即达峰值，随后降低，至再灌注12h达低谷又有所回升，当于缺血早期使用N-乙酰半胱氨酸，即可减轻缺血再灌注NOS的增高，又可减轻后期NOS的降低，并伴随心肌梗死范围的缩小，提示NO、NOS于再灌注不同时期的病理生理效应是不同的[11]。另一组大量肾缺血再灌注伤的研究显示，当用不含中性粒细胞（PMN）的灌注液灌注时，NO使肾小球滤过率和肾小管的钠重吸收率降低，用NOS抑制剂NG-nitro-L-arginine(L-NNA)可改善这些变化，但当用含PMN的灌注液灌注时，NO则使PMN在缺血组织中的滞留减少并改善肾小球滤过率及肾小管对钠的重吸收功能，这时如加用L-NNA反而加剧肾的缺血再灌注损伤[19]。因此，有必要对多种属的动物进行不同状态下的多时相点的动态观察，并对NO、NOS进行严格的定量分析并进行干预，观察调整其表达缺血再灌注损伤的影响及其机制，以期达到预防缺血再灌注损伤的目的。

综上所述，NO、NOS与缺血再灌注损伤有密切的关系，但其确切的作用机制仍不清楚，可能在不同的动物、组织，在不同的缺血再灌注时其含量、活性及病理生理效应是不同的，在缺血再灌注的不同时期用不同的方法调整NOS、NO的表达量，使其维持在一个适当的范围，可望成为一种新的抗缺血再灌注损伤疗法，故有必要对其作进一步的深入研究。

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