龙山卷丹百合无症病毒的检测

摘 要：以龙山卷丹百合的病叶作为试材，采用DAS-ELISAS检测法对样品进行百合无症病毒的检测，检出率为58.3%；提取总RNA为模板，通过RT-PCR扩增其外壳蛋白基因，大小为287 bp，和预期条带大小一致。经Blast比对发现，该基因片段与Genbank上发表的LSV CP基因序列同源性达92%以上。

关键词：卷丹百合；RT-PCR；DAS-ELISA；百合无症病毒

中图分类号：S682.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.006

卷丹百合是湖南省一种具有浓郁地方特色的农产品，不仅具备食用和药用双重价值，还有较强的观赏价值，主要分布于湘西州龙山县、邵阳市隆回县和永州市东安县，其中以龙山县栽培历史最为久远，在省内外享有很高的知名度，食用百合生产已经成为当地农户致富的特色创收项目之一。但长期以来，由于百合种球生产主要靠扦插和分球等无性繁殖方式进行，病毒感染严重，导致产量和质量下降，产区出现百合植株的黄化、皱缩和畸形等衰退现象，给食用百合产业带来巨大的经济损失，严重影响农户的生产积极性。

到目前为止，已相继报道对百合具有侵染性的病毒达10种以上，其中危害较为严重的有3种：百合无症病毒（LSV）、黄瓜花叶病毒、郁金香碎锦病毒 [1-4]。百合无症病毒属于线性病毒科、香石竹潜隐病毒属，是分布范围最广、危害最大的病毒之一[5]，主要通过汁液传播，也可以通过叶片接触或昆虫媒介的方式传播。由于单独侵染百合时常使寄主表现为隐症，故称为百合无症病毒；与其它病毒复合侵染时，会出现脉明、畸形、坏死斑等症状[6-9]。 近年来，国内外对侵染百合的LSV有较多的研究报道[10-13]，但关于湖南龙山卷丹百合感染LSV的报道尚少。本研究通过对湖南龙山卷丹百合实地调查，采回病样，采用血清学和RT-PCR法对卷丹百合感染LSV的情况进行检测和鉴定，旨在为湖南龙山卷丹百合病毒检测、病毒病的防治和无毒苗的培育提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 DAS-ELISA检测法

1.1.1 材 料

卷丹百合样品于2012年7月采自湖南省湘西州龙山县百合产区，田间感病株呈现出叶脉黄化，部分叶片卷曲，植株矮缩束顶的不正常生长现象。

阳性对照（含LSV病毒样品）和阴性对照（不含LSV病毒样品）均购自上海卡奴生物科技有限公司的LSV DAS-ELISA检测试剂盒。

1.1.2 方 法 称取0.5 g新鲜百合病叶置于研钵中，加入液氮充分研磨，并转移到装有200 μL裂解液的1.5 mL离心管中，匀浆；4 ℃，15 000 g，离心5 min，弃沉淀，-20 ℃保存上清。病毒检测方法参照试剂盒操作步骤进行。

1.1.3 判断标准 酶标仪在450 nm处读取吸收值（OD值）。结果判断标准为：临界值（CO）=阴性对照均值+0.15，样品OD值临界值，为百合无症病毒（LSV）阳性。

1.2 RT-PCR检测法

1.2.1 材料及主要试剂 以DAS-ELISA方法检测呈现阳性的百合病叶为试材，进一步进行百合无症病毒的分子检测。

cDNA第一链合成试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；植物类病毒RNA核酸提取试剂盒购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司；RT-PCR反应所采用的试剂High dNTPs、10×PCR Buffer、Taq DNA多聚酶则购于上海生工生物工程有限公司；DNA凝胶纯化回收试剂盒购自Vigene Biotech公司。

1.2.2 引物设计与合成 根据NCBI已发表的LSV病毒的CP基因序列，设计特异性引物：上游引物p1： 5'-ACGCTGGACTGCGGA-3'，下游引物p2：3'-AAGCCAAAGGTCCGAGGG-5'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 总RNA的提取 称取0.5 g新鲜的百合病叶，放置于已灭菌的研钵中，加入液氮迅速研成粉末，转移到加有200 μL裂解液的1.5 mL去RNA酶的离心管中，匀浆，室温静置5 min；4 ℃，15 000 g，离心15 min，取上清液。

另取1.5 mL离心管，依次加入150 μLBinding buffer，50 μL上清，20 μL纳米磁珠（MNP），混匀；70 ℃恒温，预热10 min，每2～3 min混匀一次；短时高速离心，去上清；加入200 μLwashing buffer I，充分混匀，去上清；加入200 μL washing buffer II，充分混匀，去上清；加入200 μL washing buffer III，充分混匀，去上清；最后加入50 μL Elution buffer，静置3 min，-80 ℃冰箱保存上清。然后加DNA消化酶去除DNA的干扰，通过1%琼脂凝胶和溴化乙锭（EB）染色后，进行电泳检测[15]。

1.2.4 cDNA 第一链的合成 提取卷丹百合病叶的RNA，按照天根公司cDNA第一链合成试剂盒说明书操作步骤合成cDNA。在20 μL反应体系中：① 5×gDNA Buffer 2 μL，Total RNA 6 μL，ddH2O 2 μL，混匀，42 ℃孵育3 min；②向①混合液中加入10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1μL，FQ-RT Primer Mix2 μL，ddH2O 5 μL，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，4 ℃保存。

1.2.5 PCR扩增 在50 μLRT-PCR反应体系中：cDNA 4 μL，上游引物、下游引物各1 μL，Taq酶0.6 μL，dNTPs 6 μL，10×PCR buffer 5 μL，ddH2O 32.4 μL；PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，再72 ℃延伸6 min，4 ℃结束反应。反应结束后，取4 μL PCR产物用含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳25 min，用Gene Snap凝胶成像仪照相并分析。

另取30 μL纯化PCR产物进行测序（南京金斯瑞生物科技有限公司进行），测得的核苷酸序列运用BLAST程序与GenBank数据库中收录的LSV序列进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 DAS-ELISA检测结果

根据显色反应得知（图1），在12个样品中有7个样品显色为阳性，5个样品为阴性。对酶标仪读取的数据进行分析（表1），7个样品的OD值大于临界值，5个样品OD值小于临界值，检出率为58.3%，这与显色反应的结果一致，初步确定龙山卷丹百合受到LSV的侵染。

2.2 RNA提取

取5 μL的总RNA在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，由图2可见，提取的总RNA有3条较清晰的条带，且均无明显的拖尾现象，其中28S和18S条带亮度较高，5S条带亮度较弱，说明总RNA完整性较好。从紫外分光光度计检测得知，OD260/OD280的比值接近1.8，说明总RNA无多糖、多酚和蛋白的污染，质量高。

2.3 RT-PCR测序结果及序列分析

以cDNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，将纯化的 PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，由图3可知，该目的条带约为300 bp，与预期片段大小一致。

测序结果表明，LSV扩增产物共有287个核苷酸。通过BLAST对所获得的LSV扩增序列与Genbank上已登录的中国浙江和北京两地区分离物（登录号分别为AY620983、EF158109）核苷酸序列进行比对，同源性高达99%；与印度分离物（AJ831416）和韩国分离物（JX962776）的同源性大于92%。以上分析结果证实，龙山卷丹百合LSV扩增产物与其它分离物的同源性较高，从而进一步表明DAS-ELISA检测呈阳性的百合样品感染了百合无症病毒。

3 结论与讨论

卷丹百合是湖南龙山县传统中药材及食用佳品，是龙山特色农业的重要组成部分，在龙山县已有50多年的栽培历史，目前已形成“种植区域化，生产规模化，加工规范化，销售市场化”的产业化格局。长期以来的无性繁殖和重土连作，种球携带大量病毒，导致种球自然退化或异化，引起品质下降、产量降低等种性退化的现象，这给卷丹百合产业带来了巨大的经济损失。本研究通过田间观察、DAS-ELISA和RT-PCR检测技术对龙山县田间百合感染LSV的情况展开调查和检测，确定产区的卷丹百合已被百合无症病毒感染。这为今后的产区百合病毒病防治和无病毒苗培育奠定了基础。

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