microRNA―31转基因小鼠脊髓损伤模型对胃肠动力障碍的修复作用

[摘要] 目的 探讨microRNA-31对脊髓损伤后胃肠动力因素的作用。 方法 将36只microRNA-31转基因小鼠和36只FVB小鼠分别设为对照组和模型组，用Impactor M-Ⅲ脊髓撞击器建立小鼠脊髓损伤模型。用BBB运动功能评分评估小鼠下肢的恢复情况。HE染色观察脊髓组织的变化。用Real-time PCR法检测生长抑素受体（SSTR2） mRNA的表达，用免疫荧光法检测一氧化氮合酶（iNOS）蛋白和SSTR2蛋白的表达。 结果 造模后第3天、第7天和第14天，脊髓组织破坏、坏死、空泡形成，胶原纤维明显增加。造模后第14天，FVB模型组与对照组比较，SSTR2 mRNA的表达明显升高（P

[关键词] 脊髓损伤；胃肠动力因素；microRNA-31转基因小鼠；生长抑素受体（SSTR2）；一氧化氮合酶（iNOS）

[中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）13-0031-05

Repairing effect of microRNA-31 transgenic mice on gastrointestinal motility disorder in spinal cord injury model

WANG Dejun1 YAN Jun1 GAO Yuantao2 LI Pengfei3 WANG Chunfang3

1.Shanxi Medical University First School of Clinical Medicine， Taiyuan 030001， China； 2.Nanchang University Queen Mary School， Nanchang 330031， China； 3.Shanxi Medical University Laboratory Animal Center， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To discuss the effect of microRNA-31 on gastrointestinal motility factors after spinal cord injury. Methods 36 microRNA-31 transgenic mice and 36 FVB mice were divided into control group and model group， respectively. Spinal cord injury model was established by Impactor M-Ⅲ spinal cord striker. The recovery condition of lower limbs in mice was evaluated by BBB locomotion score， and the changes of spinal cord tissues were observed by HE staining. Expression of SSTR2 mRNA was detected by real-time PCR and expressions of iNOS protein and SSTR2 protein were detected by immunofluorescence method. Results At day 3， day 7， and day 14 of modeling， the spinal cord tissues were destroyed and necrotic with vacuolization， and collagenous fiber was markedly increased. At day 14 of modeling， when compared with the control group， the expression of SSTR2 mRNA was significantly higher（P

2.2脊髓打击前后组织形态学改变

正常组脊髓组织结构完整，神经细胞形态正常，分布均匀，尼氏体清晰，细胞膜、细胞核及组织间隙均正常，脊髓损伤后，组织出血、疏松水肿、细胞空泡变性、部分细胞细胞核固缩、神经纤维溶解、消失，胶原纤维增多伴淀粉样变性，灰质增生侵入白质。见图1。

2.3免疫荧光检测

从免疫荧光检测结果可以看出，正常组胃窦组织iNOS和结肠组织SSTR2的阳性细胞数比较少，脊髓损伤后14 d时，胃窦组织iNOS和结肠组织SSTR2的阳性细胞数明显增多，同时可以看出，microRNA-31转基因小鼠与FVB小鼠比较，FVB小鼠的阳性细胞数量比microRNA-31转基因小鼠的阳性细胞数量相对较多。见封三图1。

2.4 RT-qPCR检测SSTR2 mRNA

RT-qPCR检测SSTR2 mRNA的表达量，第3组与第1组比较，差异有统计学意义（P

3讨论

microRNA具有基因转录后的负性调节作用，抑制多种蛋白的表达，通过上调和下调microRNA的表达，可以对胃肠动力产生调节作用，新近研究发现，microRNA可以调控胃肠平滑肌细胞合成干细胞因子[7]。有研究[8，9]发现，通过调节相应microRNA的表达，可以影响肠平滑肌及上皮组织的完整性，表明不同microRNA参与调控了消化道黏膜上皮细胞及平滑肌细胞的增生、分化及成熟。近年研究证明，microRNA在炎症反应时骨髓肥大细胞的分化、增殖和功能上起重要作用，调节肠易激综合征的免疫应答过程[10]。目前，microRNA-31对胃肠动力有关的下游基因的调控还未见报道。

小鼠脊髓损伤后，BBB评分由0分逐渐增大，组织学观察损伤初期脊髓组织出现出血、坏死、水肿，符合临床脊髓损伤的病理变化。说明脊髓损伤的模型已成功建立。胃肠运动信息系统由信号分子如胃肠肽、信号接收系统如胃肠肽受体、细胞内信号转导系统共同组成。信号分子如有抑制作用的生长抑素异常，可导致胃肠动力障碍[11]。结肠SSTR2的表达较高，尤其是肌细胞和黏膜上皮细胞[12]。一氧化氮合酶是一氧化氮合成过程中的唯一限速酶，在胃肠道分布广泛，与消化道的生理调控和发病机制关系密切。

有实验发现[13]，脊髓损伤后小鼠组织中的生长抑素和一氧化氮合酶均增高，它们均可以调节脊髓损伤后的胃肠运动。本实验结果表明，与对照组比较，模型组结肠组织SSTR2 mRNA明显增高（P

生长抑素是一种广泛分布的抑制性脑肠肽，可抑制胃固体排空和胃张力性收缩[14]，另外生长抑素可参与调节胃肠蠕动，其作用机制包括：①通过D细胞旁分泌效应直接抑制大多数肌间丛神经元的冲动发放，在神经和神经元连接处释放引起肠运动抑制；②通过神经内分泌作用直接抑制胃肠道的运动；③通过抑制乙酰胆碱作用和抑制胃肠道激素起间接作用[15]。胃肠运动是受兴奋性和抑制性神经双重支配，当两者失衡时，就会发生病理生理紊乱。NO是其中一种重要的抑制性递质，当其含量发生改变时，就会打破这种平衡使胃肠动力紊乱。NOS作为NO合成的唯一限速酶，在生理状态下iNOS分布于胃窦肌层的平滑肌细胞的胞浆内，在病理状态下，胃肠内的细胞可由诱导因子作用产生iNOS的表达。由于NOS与胃肠动力障碍的发生机理密切相关，NOS的改变会影响胃肠的运动功能，所以选择了神经递质NOS。从结果中可以推断出，高表达量的microRNA-31通过抑制生长抑素和一氧化氮合酶的表达，促进了神经元对肠运动冲动的发放，促进了胃张力性收缩，维持了胃肠动力的平衡，使胃肠动力障碍得到恢复。

综上所述，手术创伤后结肠组织SSTR2 mRNA的表达上调，SSTR2蛋白iNOS蛋白的表达增高可能参与了胃肠动力障碍的发生，通过microRNA-31转基因小鼠与FVB小鼠的比较，可以推测出高表达的microRNA-31参与了脊髓组织损伤后胃肠动力障碍的恢复。为此，我们可以设计出microRNA-31芯片或者胶囊，为临床上治疗手术创伤后胃肠动力障碍提供一个良好的治疗方案。

[参考文献]

[1] 黄保民，李颖，马仲丽，等. 大承气汤对里实热证大鼠胃肠激素GAS、MTL、VIP、NT的影响[J]. 北京中医药大学学报，2010，335（10）：683-687.

[2] Chen X， Xia J，Xia Z，et al. Potential functions of microRNAs in starch metabolism and development revealed by miRNA transcriptome profiling of cassava cultivars and their weild progenitor[J]. BMC Plant Biol，2015，15（1）：33.

[3] Xie M，Zhang S，Yu B. microRNA biogenesis，degradation and activity in plants[J]. Cellul Molecul Life Sci，2015，72（1）：87-99.

[4] Das A，Ganesh K，Khanna S，et al. Engulfment of apoptotic cells by macrophages：A role of microRNA-21 in the resolution of wound inflammation[J]. J Immunol，2014，192（3）：1120-1129.

[5] 田峰. 小鼠标准化脊髓损伤模型的建立及miR-31转基因小鼠脊髓损伤机制研究[D]. 山西医科大学，2015.

[6] Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rate[J]. J Neurotrauma，1995，12（1）：1-21.

[7] Wu B，Liu L，Gao H，et al. Distribution of interstitial cells of cajal in meriones unguiculatus and alterations in the development of incomplete intestinal obstruction[J]. Histol Histopathol，2013，28（12）：1567-1575.

[8] Zeng L，Carter AD，Childs SJ. miR-145 directs intestinal maturation in zebrafish[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009， 106（42）：17793-17798.

[9] Hino K，Tsuchiya K，Fukao T，et al. Inducible expression of micro-RNA-194 is regulated by HNF-alpha during intestinal epithelial cell differentiation[J]. RNA，2008，14（7）：1433-1442.

[10] Mayoral RJ，Pipkin ME，Pachkov M，et al. Micro-RNA-221-222 regulate the cell cycle in mast cells[J]. J Immunol，2009，182（1）：433-445.

[11] 刘凯，齐清会. 胃肠肽受体及受体后信号传导与胃肠动力[J]. 世界华人消化杂志，2002，10（12）：1445-1449.

[12] Iyo T，Kaneko H，Konagaya T，et al. Effect of intragastric ammonia on gastrin，somatostatin and somatostatin receptor subtype 2 positive-cells in rat antral mucasa[J]. Life Sci，1999，64（26）：2497-2504.

[13] 洪丽莉. 脊髓损伤模型大鼠的胃肠动力障碍及其电针调整的研究[D]. 广州中医药大学，2008.

[14] De Herder WW，Lam berts SW. Somatostatin analog the rapy in treatment of gastro intestinal disorders and tumors[J]. Endocrine，2003，20（3）：285-290.

[15] Cuomo R，Samelli G，Grasso R，et al. Functional dyspepsia symptoms，gastric emptying and satiety provocative test analysis of relationships[J]. Scand Jgasroenterol，2001， 36（9）：1030-1039.

（收稿日期：2016-03-15）