双相体系中固定化酶水解黄芩苷制备黄芩素的研究

[摘要] 该文研究了双相体系中固定β-葡萄糖苷酶水解黄芩苷制备黄芩素的最佳工艺条件并考察其产率，考察了黄芩素在多种有机溶剂中的溶解性及其在水与有机溶剂中的分配系数，确定了固定化酶催化黄芩苷酶解反应在醋酸缓冲液和氯仿组成双相体系中进行。以海藻酸钠为载体，用交联-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶，并测定了其最适反应温度，最适反应pH，米氏常数，热稳定性和pH稳定性等酶学性质。比较了固定化酶在双相体系中水解黄芩苷的产率，得出最佳反应条件：pH 5.0的醋酸缓冲液和三氯甲烷组成的双相体系，反应温度50 ℃，反应时间10 h，黄芩素产率为85.28%。与单相反应体系相比，双相反应体系中反应速度和产率均有所提高。

[关键词] 固定化β-葡萄糖苷酶；黄芩苷；黄芩素；双相体系；生物催化

黄芩素即黄芩苷元，是一种黄酮类化合物，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的主要活性成分之一，其具有降低脑血管阻力、改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用，临床用于脑血管病后瘫痪的治疗[1]。黄芩苷的体内代谢动力学研究表明，口服黄芩苷一般需经胃肠道菌丛酶解或肝微粒体转化成黄芩素后，被人体空肠段快速吸收，故黄芩苷功效的发挥受生物因素影响很大，如胃肠道功能、菌丛种类和数量、生理病理状态等。因此直接由黄芩素开发的制剂应可避免上述问题[2]。

传统提取方法一般直接从药材中提取黄芩素，但其在黄芩中含量低，其质量分数只有0.04%～0.28%，因此提取成本较高。此外，黄芩素结构中含有3个邻位酚羟基，水中微量的金属离子、氧气可促进黄芩素氧化为醌类衍生物而显绿色，生成副产品[3]。提取的难度限制了黄芩素的生产和应用。近期很多研究开始使用酶解法制备黄芩素，在很大程度上提高了黄芩素的来源[4-5]。酶水解法具有反应条件温和、副产品少、产物品质高等优点，但酶解率相对不高，酶无法回收利用，生产成本高，且酶容易失活，不易储存。

近年来，双相体系酶解反应以反应速率快、产率高、副产物少等特点而被关注，但是由于酶在有机溶剂中易失活，所以常以固定化酶的形式进行反应[6-9]。本文对固定化酶转化黄芩苷进行了研究，采用了水和三氯甲烷组成的两相体系进行酶催化反应，以达到提高反应速率和产率的目的。

1 材料

85-2型恒温磁力搅拌器（上海青浦沪西仪器厂）；HHS-2型电热恒温调节器（上海沪南科学仪器联营厂）；WFZ-UV-2000型紫外-可见分光光度计（上海尤尼科仪器有限公司）；RE52-2型旋转蒸发器（上海沪西仪器厂）；Agilent 1100高效液相色谱仪（G1314A型VWD检测器，Agilent ChemStation色谱工作站）。

海藻酸钠（CP， 国药集团化学试剂有限公司）；戊二醛（25%水溶液，BR， 上海凌峰化学试剂有限公司）；黄芩苷（纯度为70%， 实验室自制）；β-葡萄糖苷酶（上海宝丰生化有限公司）。黄芩苷、黄芩素对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为 110715-200815，111595-200905）；其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 DNS法测定β-葡萄糖苷酶活力

取β-葡萄糖苷酶溶液0.1 mL，加入0.5%的黄芩苷溶液1.9 mL（用0.2 mol・L-1 pH 5.0的醋酸钠缓冲液配制），50 ℃水浴反应30 min后，立即加入1 mol・L-1碳酸钠溶液2 mL终止反应，然后用DNS法测定生成的葡萄糖含量[10-11]。

酶活力定义为在50 ℃，pH 4.5条件下，1 mg酶（或1 g固定化酶）每1 min水解黄芩苷反应生成1 mg葡萄糖醛酸的酶活力为一个酶活力单位（U）。

2.2 黄芩苷和黄芩素分配系数的测定

精密配制0.1 g・L-1的黄芩苷对照品母液，分别取黄芩苷对照品母液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，配制成10 mL溶液；分别测定吸光度，以黄芩苷溶液质量浓度Y（g・L-1）对吸光度（X）进行回归分析。

取pH 4.5的缓冲液10 mL与有机溶剂10 mL混合后，加入黄芩苷5 mg，充分混合，50 ℃振荡1 h，室温静置分层后，分别取上层和下层溶液0.1 mL于1.5 mL离心管中，水浴加热挥干溶剂后，定容至10 mL，测定其吸光度，并计算分配系数P。P=有机相中黄芩苷的质量浓度/水相中黄芩苷的质量浓度。黄芩素分配系数的测定方法与黄芩苷相同。

2.3 β-葡萄糖苷酶的固定化[8]

称取海藻酸钠0.6 g加去离子水20 mL，加热溶解。按比例加入一定浓度的游离β-葡萄糖苷酶酶液5 mL，充分混合。然后加入25%戊二醛溶液0.64 mL，室温搅拌交联2 h。用注射器吸取上述溶液，以10 cm左右的高度逐滴滴入100 mL一定浓度的氯化钙溶液中，形成直径约为3 mm的光滑凝胶小球，静置硬化2 h。滤出凝胶颗粒，用去离子水洗涤，吸干表面水分，贮存于4 ℃冰箱中。固定化酶活力回收率=固定化酶总活力/加入的游离酶总活力×100%。

2.4 β-葡萄糖苷酶的酶学性质的测定

2.4.1 最适反应pH 分别用pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5的醋酸缓冲液测定β-葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的pH为最适反应pH。

2.4.2 最适反应温度 分别在40，45，50，55，60，65 ℃温度下测定β-葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的温度为最适反应温度。

2.4.3 米氏常数Km[12] 分别吸取5 mmol・L-1的黄芩苷溶液0.8，2，3，4 mL于10 mL量瓶中，定容至刻度，配制成0.4，0.8，1.2，1.6 mmol・L-1的黄芩苷溶液。分别以上述黄芩苷溶液为底物，在最适反应温度和最适反应pH条件下测定其酶活，根据Linewaeaver-Burk双倒数法计算米氏常数。

2.4.4 pH稳定性 将游离酶和固定化酶分别置于pH 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的醋酸缓冲液中，在最适反应温度条件下水浴保温1 h，然后按2.1项下测定方法测定酶活力。

2.4.5 热稳定性 将游离酶和固定化酶分别置于不同温度中（30，40，50，60，70，80，90 ℃）水浴保温1 h，然后按2.1项下测定方法测定相应的酶活力。

2.5 β-葡萄糖苷酶水解黄芩苷

2.5.1 单相反应 取黄芩苷0.5 g，置三角烧瓶中，加入一定量游离β-葡萄糖苷酶和醋酸缓冲液200 mL，恒温振荡反应一定时间。

2.5.2 双相反应 取黄芩苷0.5 g，置三角烧瓶中，加入一定量固定化β-葡萄糖苷酶、醋酸缓冲液200 mL和三氯甲烷200 mL，恒温振荡反应一定时间。黄芩素产率=（反应后黄芩素产量×黄芩素纯度）/（反应前黄芩苷投料量×黄芩苷纯度）×100%。

2.6 黄芩素的分离与纯化

2.6.1 单相反应 用三氯甲烷萃取反应液（200 mL×3），合并萃取液，加入适量无水硫酸钠干燥，振荡30 min，抽滤。减压回收滤液，真空干燥1 h。然后用三氯甲烷重结晶，产物称重并保存。

2.6.2 双相反应 过滤分离固定化酶凝胶颗粒和反应液，并分离有机相和水相，用三氯甲烷萃取水相反应液（200 mL×2），合并萃取液和有机相反应液，加入适量无水硫酸钠干燥，振荡30 min，抽滤。减压回收滤液，真空干燥1 h。然后用三氯甲烷重结晶，产物称重并保存。

2.7 分析方法[13]

2.7.1 HPLC测定黄芩苷和黄芩素含量 Kromasil RR100-5C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），流速1 mL・min-1，柱温35 ℃，进样量20 μL，检测波长为280 nm。用外标法作标准曲线，计算样品浓度。

2.7.2 TLC薄层检测 用毛细管点样于聚酰胺薄膜板，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2），在365 nm紫外灯下检测。

3 结果与讨论

3.1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质的测定

3.1.1 酶反应的最适温度 分别在40，45，50，55，60，65 ℃温度下测定游离酶和固定化β-葡萄糖苷酶活力。以反应温度为横轴，相对酶活（相对酶活=酶活力/最高酶活力）为纵轴作图，结果见图1。温度为50 ℃时，游离β-葡萄糖苷酶水解黄芩苷的活力最高，40～65 ℃固定化酶的相对酶活力明显高于游离酶的相对酶活力，这也证明了酶的固定化能非常有效地提高β-葡萄糖苷酶的耐热性能，相对于游离酶能更好地适应温度的变化。

3.1.2 最适反应pH 分别用pH 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5的醋酸缓冲液测定游离酶和固定化酶活力。以pH为横轴，相对酶活为纵坐标，结果见图2。游离酶和固定化酶的反应最适pH分别为4.5，5.0。考察pH在3.0～4.5的固定化β-葡萄糖苷酶相对酶活数据可知在该范围内pH发生变化时固定化酶的相对活性高于游离酶，可见β-葡萄糖苷酶通过固定化在一定范围内减小了反应pH变化对酶活力的影响，提高了不同pH条件下反应的稳定性。

3.1.3 酶的米氏常数Km 用双倒数法作图法计算出游离酶和固定化酶的米氏常数Km分别为0.004 7，0.083 0 mol・L-1。游离酶的米氏常数Km比固定化酶的Km小，根据米氏常数的定义，Km大，表明亲和力小；Km小，表明亲和力大，因此游离β-葡萄糖苷酶对于底物黄芩苷的亲和力比固定化β-葡萄糖苷酶大，可能是由于固定化酶的载体的存在使得酶与底物的结合有空间位阻，导致固定化酶与底物之间的亲和力小于游离酶与底物的亲和力。

3.1.4 热稳定性 游离酶和固定化酶在不同温度下的稳定性变化趋势基本一致，但与游离酶相比，固定化酶的热稳定性有了一定的提高，见图3，说明固定化对于提升β-葡萄糖苷酶的耐热性有一定的作用。3.1.5 pH稳定性 固定化酶在不同pH下的稳定性与游离酶相比有了明显的提高，尤其是在pH 7～10，固定化酶活力下降趋势较为平缓，而游离酶则几乎没有活性，见图4，说明固定化提高了酶的酸碱耐受性，尤其是碱的耐受性。

3.2 β-葡萄糖苷酶水解黄芩苷反应条件的确定

3.2.1 双相反应体系的确定 黄芩苷的回归方程为Y=0.985 5X-0.003 7，r=0.998 9，黄芩素的回归方程为Y=2.448 5 X-0.055 2，r=0.999 0。黄芩苷和黄芩素在0.002～0.01 g・L-1有良好的线性。

选择对黄芩素有良好溶解性的有机溶剂乙酸乙酯、三氯甲烷、甲基异丁基甲酮，测定黄芩苷和黄芩素的分配系数，结果见表1。在水和三氯甲烷组成的两相体系中，黄芩苷主要分布在水层，而黄芩素主要分布在有机层，符合实验的需要，即黄芩苷在水相与酶进行催化反应，反应的同时将黄芩素萃取到有机相，因此选择三氯甲烷作为本实验的有机相溶剂。

3.2.2 最佳反应时间的测定 0.5 g黄芩苷与0.9 U游离酶于pH 5.0和温度50 ℃的条件下，分别反应2，4，6，10，12 h，考察生成的黄芩素的产率。0.5 g黄芩苷与0.5 U固定化酶于pH 4.5和温度50 ℃的条件下，分别在双相中反应2，4，6，10，12 h，考察生成的黄芩素的产率，结果见表2，反应时间10 h时，游离酶和固定化酶生成的黄芩素均最多。

综上所述，确定游离β-葡萄糖苷酶水解黄芩苷最适反应条件为：温度50 ℃，pH 5.0，反应时间10 h；固定化β-葡萄糖苷酶双相水解黄芩苷最适反应条件为：温度50 ℃，pH 4.5，反应时间10 h。此外，由表2可以看出，在相同反应时间内，固定化酶双相反应的产率均比游离酶单相反应的产率高，说明前者的反应速率较快，可能由于双相反应在反应的同时将产物黄芩素萃取到有机相中，水相中产物的量减少，更利于反应的进行。且固定化酶双相反应的最终产率比游离酶单相反应有明显提高。

根据上述实验结果，以最适反应条件分别用游离酶和固定化酶在单相和双相体系中水解黄芩苷，重复试验3次，结果见表3。从实验结果可以看出，该方法具有良好的稳定性，适应于生产。

3.3 黄芩苷和黄芩素样品的检测

3.3.1 TLC检测 用TLC检测游离酶和固定化酶水解黄芩苷10 h后的反应液，游离酶和固定化酶水解黄芩苷的反应液中均只有黄芩素而无黄芩苷，表明黄芩苷已经水解完全，且无明显副产物生成。

3.3.2 HPLC检测 用HPLC检测黄芩苷和黄芩素产品，见图4，黄芩苷样品的纯度为70.10%，黄芩素产品的纯度为82.96%，根据检测结果，计算得到游离酶反应的产率为79.29%，固定化酶反应的产率为85.63%。

4 结论

本文进行了固定化酶在双相体系中转化黄芩苷的研究。将β-葡萄糖苷酶以海藻酸钠为载体，用交联-包埋法进行固定化，所得固定化酶回收率为40.92%。固定化酶水解黄芩苷的反应最适温度50 ℃，最适pH 5.0，最佳反应时间10 h，黄芩素产率85.28%。

氯仿为黄芩素的良好溶剂，因此本文采用了水和氯仿组成的双相体系进行酶催化反应，在反应的同时使黄芩素从水相中富集到氯仿相，消除黄芩素对催化反应的抑制作用。结果表明，固定化酶在单相体系中的反应速度和产率都不如在双相体系中理想。双相体系反应黄芩素产率比单相体系有明显提高。

同时，将酶固定化后进行反应，不仅增加酶的热稳定性和pH稳定性，在一定程度上解决了酶易失活的问题；而且易于分离，由于固定化酶为固体凝胶颗粒，可以通过离心或过滤等方法与反应液分离，然后进行回收利用。此外，双相体系在反应时已经进行了一次萃取，因此后续的萃取步骤由三次萃取减少为二次萃取，减少了萃取的时间。该工艺方法操作简单，易于工业化生产，有着良好的应用前景。

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Study on hydrolysis of baicalin into baicalein by immobilized

β-glucosidase in a two-phase system

YANG Yi-shun1， CHENG Tao1， YANG Jun1，2， ZHANG Tong1*， CAI Zhen-zhen1

（1.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；

2.Xiangshan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200020， China）

[Abstract] The optimum conditions of baicalin hydrolysis into baicalein by immobilized β-glucosidase in a two-phase system was studied and the yield was observed. A two-phase system comprising of sodium acetate buffer and chloroform was determined by comparing the solubleness of baicalein in different solvents and partition coefficient of baicalein in related aqueous-organic two-phase system. β-Glucosidase was immobilized by the crosslinking-embedding method using sodium alginate as the carrier. The optimum reaction temperature， pH value， Michaelis constant， the thermal stability and pH stability were assayed. By comparing the yield of baicalin hydrolysis into baicalein by immobilized β-glucosidase in two-phase system， the optimum reaction conditions were determined-the optimum reaction temperature， pH value and time were 50 ℃， 5.0 and 10 h，respectively. The yield of baicalein was 85.28%. Compare with one-phase system， two-phase system had an advantage in reaction rate and yield.

[Key words] immobilized β-glucosidase； baicalin； baicalein； two-phase system； biocatalysis

doi：10.4268/cjcmm20140423