microRNA―21逆向调控RECK促进乳腺癌细胞侵袭转移的研究

【摘要】 目的 研究 microRNA-21参与乳腺癌侵袭转移的调控机制。方法 采用实时定量反转录 -聚合酶反应 （RT-PCR）方法检测MDA-435、MDA-231和 MCF-7乳腺癌细胞株 microRNA-21的表达；采用 transwell方法测定上述三株乳腺癌细胞体外侵袭转移能力；人工合成 microRNA-21干扰序列 ， 转染MDA-231、MDA-435乳腺癌细胞 ， 观察对细胞侵袭能力的影响；应用 Western blot检测逆转诱导蛋白（RECK）的表达；采用荧光报告基因实验检测 RECK与 microRNA-21的结合情况。结果 MCF-7、MDA-231及 MDA-435细胞株中均具有 microRNA-21高表达 ， 且表达量 MDA-435>MDA-231>MCF-7， 其中 ， 具有高侵袭特性的 MDA-435细胞具有最高水平 microRNA-21的表达为 （4.51±0.71）， MDA-231细胞具有中等水平的 microRNA-21表达为 （2.67±0.27）， MCF-7细胞表达microRNA-21水平相对较低为 （1.23±0.11）， 比较差异有统计学意义（P

【关键词】 乳腺癌；侵袭；microRNA-21；伴 Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白；RNA干扰

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.16.195

【Abstract】 Objective To research regulation mechanism of microRNA-21 for breast cancer invasion and metastasis. Methods Real-time quantification polymerase chain reaction （RT-PCR） was applied to detect miR-21 expression in MDA-435， MDA-231 and MCF-7 breast cancer strains. In vitro invasion and metastasis of these three strains were detected by transwell method. Transfection on MDA-231 and MDA-435 cell was made by synthetic microRNA 21 interference sequence to observe the influence on cell invasion. Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs （RECK） protein expression was detected by Western blot， and combination of RECK and microRNA-21 was detected by luciferase reporter gene test. Results All MCF-7， MDA-231 and MDA-435 strains had high expressed microRNA-21， and their expression volume were shown as MDA-435>MDA-231>MCF-7. MDA-435 with high invasion feature showed the highest microRNA-21 expression level as （4.51±0.71）， followed by microRNA-21 expression in MDA-231 as （2.67±0.27） and in MCF-7 as （1.23±0.11）， and their difference had statistical significance （P

【Key words】 Breast cancer； Invasion； microRNA-21； Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs； RNA interference

microRNAs是新近识别的人体内一类内源性非编码小分子核糖核酸 （RNA）， 通过与靶基因互补结合 ， 在转录后水平调控靶蛋白表达 ， 从而参与生物体各项生物学活动。前期研究显示[1]， microRNA-21在乳腺癌细胞中高表达并与阿霉素耐药有关 ， 并有研究提示[2]， microRNA-21高表达与乳腺癌患者转移有关。本研究拟采用 RNA干扰技术降低 microRNA-21的表达 ， 观察对乳腺癌细胞侵袭转移的影响 ， 并观察对其潜在靶基因：伴Kazal域的富含半胱氨酸的 RECK的表达调控。本研究旨在为深入阐述乳腺癌侵袭转移调控机制提供实验室依据。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-231和 MDA-435由山东省肿瘤防治研究院基础研究中心常规保存。于含10%小牛血清的细胞冻存培养基 （DMEM）中 ， 37℃、5% CO2条件下常规培养。

1. 1. 2 主要试剂和仪器 脂质体 Lipofectamine 2000、Trizol试剂、实时定量 RT-PCR试剂盒、matrigel胶购自美国 Invitrogen 公司 ， transwell小室购自美国 Coning公司 ， 蛋白提取试剂盒购自生工生物工程 （上海 ）股份有限公司。RECK和 β-actin抗体购于美国 Santa Cruz公司。定量 PCR仪 ABI7000购于美国 ABI公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 实时定量 RT-PCR检测microRNA-21的表达 应用Trizol提取细胞RNA。microRNA-21逆转录引物为 5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA3’； 上游引物为 5’GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG3’， 下游引物为 5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’； 应用互补脱氧核糖核酸（cDNA）逆转录试剂盒进行逆转录 ， 采用定量 PCR试剂盒进行PCR。应用 U6 RNA的表达进行标准化计算?CT值， 重复实验 3次， 以“均数 ±标准差”表示。

1. 2. 2 细胞转染 根据 Pubmed数据库中的 microRNA-21基因序列 ， 设计合成 microRNA-21干扰序列为 5’-UCAA CAUCAGUCUGA UAAGCUA-3’， 对照序列为 5’-CAGUACU UUUGUAGUACAA-3’， 上述序列由上海吉玛技术有限公司设计合成。以 Lipofectamine 2000为载体， 转染MDA-231、MDA-435细胞株。具体步骤为：转染前 1 h更换为无血清的 DMEM培养液 ， 将 siRNA-脂质体复合物加到含有细胞及培养基的实验组孔中；阴性对照的细胞中只加入脂质体。细胞同时置 CO 2培养箱 37℃中培养 5 h， 更换培养液， 继续培养24～48 h。

1. 2. 3 细胞侵袭实验 应用 DMEM按 1∶5 稀释 Matrigel 基质胶 ， 将 transwell 小室置于 24 孔板中 ， 取 100 ?l稀释胶加至上室 ， 室温干燥过夜。siRNA转染组细胞及未转染组细胞培养 48 h后 ， 应用无血清的 DMEM调整细胞密度至 3×10 5/ml， 转至 Matrigel包被的 transwell小室中 （6孔板 ， 8 ?m小孔）。在小室下层加入含 10%血清的 DMEM作为趋化剂。孵育 20 h后 ， 应用棉签拭去非侵袭性细胞。应用结晶紫固定并染色。在 100倍荧光显微镜下计数细胞。

1. 2. 4 Western Blot检测 RECK蛋白的表达 MDA-231、MDA-435siRNA转染组细胞及未转染组细胞培养 24 h， 应用细胞裂解液[0.15 mol/L NaCl， 0.05 mol/L pH7.5 Tris-Cl， 2 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）， 0.5%Triton-100， 5 mmol/L DTT， 0.2 mmol/L PMSF， 2 mg/L apoptinin]提取细胞总蛋白。取 75 ?g蛋白行 8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ， 以 100 V电转移 1 h将凝胶上的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。5%脱脂奶粉封闭 2 h。加入 RECK一抗 （1∶250）、β-actin一抗 （1∶500）室温孵育 2 h， 加入适当比例稀释的羊抗鼠或羊抗兔二抗常温孵育1 h。加 ECL显色剂于暗室曝光显像， 行图像分析。

1. 2. 5 荧光素酶报告基因实验 扩增包含 RECK 3’UTR区靶位点的引物为上游 5’- ATTAACTAGTACCTCTATTCGCCA CACAG-3’；下游 5’-CTACATCAGCA CTGACATATTCTG -3’。经限制性内切酶 （SpeI）切 PCR产物后 ， 将 RECK 3‘UTR克隆入pGL3荧光素酶质粒载体， 转染入MDA-435细胞株。5 h后， 继续转入 50 nMmicroRNA-21 inhibitor或对照序列。24 h后 ， 裂解细胞检测荧光素酶活性。pGL3质粒作为共转染的对照。每次转染实验重复 2次。

1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P

2 结果

2. 1 乳腺癌细胞株 microRNA-21基因表达 应用 Taqman PCR方法检测 3种乳腺癌细胞株（MCF-7、MDA-231和 MDA-435）microRNA-21的表达。其中， 具有高侵袭特性的 MDA-435细胞具有最高水平 microRNA-21的表达为 （4.51±0.71）， MDA-231细胞具有中等水平的 microRNA-21表达为 （2.67±0.27）， MCF-7细胞表达microRNA-21水平相对较低为 （1.23±0.11）， 比较差异有统计学意义（P

2. 2 乳腺癌细胞株侵袭转移能力的测定 采用 transwell方法测定侵入滤膜的细胞数 ， 判定上述三株乳腺癌细胞侵袭转移能力。结果显示 ， MDA-435细胞侵袭力最高为 （425.4±35.0）细胞数 /视野 ， MCF-7最低为 （142.7±13.4）细胞数 /视野 ， MDA-231居中为 （263.7±24.4）细胞数 /视野。三组细胞侵袭力比较差异有统计学意义（P

2. 3 乳腺癌细胞株 microRNA-21基因干扰效果评价 将 anti-microRNA-21分别转染入 MDA-231和 MDA-435细胞 ， 与对照组比较 ， 两种细胞株转染 anti-microRNA-21后分别引起 56%和 67%的 microRNA-21表达量降低 ， 比较差异有统计学意义（P

2. 4 microRNA-21表达改变对乳腺癌细胞株侵袭转移的影响将anti-microRNA-21转染入MDA-231细胞， 与阴性对照组比较 ， anti-microRNA-21引起了 34%细胞侵袭数目的减少。将 anti-microRNA-21转染入 MDA-435细胞 ， 结果表明 anti-microRNA-21引起68%侵袭细胞数目的下降。见图3。

2. 5 microRNA-21对 RECK的表达调控影响 将 anti-microRNA-21分别转染入 MDA-231细胞和 MDA-435细胞。Western blot 结果显示 ， MDA-231及 MDA-435细胞无或少许 RECK表达 ， 在 MDA-435细胞中 anti-microRNA-21下调 ， 引起较明显的 RECK蛋白的表达增加。MDA-231细胞中 RECK的表达亦有增强 ， 但变化不明显。见图4。为了进一步证实 RECK mRNA的3’UTR区是 microRNA-21的功能性靶点 ， 进行了荧光素酶实验 ， 与阴性对照组比较 ， 共转染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435细胞荧光酶活性增加了38%。见图5。

3 讨论

>50%的人类 miRNA定位于与肿瘤相关的基因组位置， 并且 miRNAs通过调控多个靶基因的表达从而调控多种细胞生物学进程 ， 提示这些分子在肿瘤中具有潜在的重要作用[3-6]。microRNA-21就是这类分子的其中之一。microRNA-21定位于染色体17q23.2， 此位点在一个常见的断裂位点 FRA17B之内。这一区域通常在结肠癌、乳腺癌和肺癌中出现扩增 ， 同时也与microRNA-21在多种类型肿瘤中过表达相一致[7-12]。本研究中 ， 发现 microRNA-21在多种乳腺癌细胞中均有高表达 ， 而且细胞内源性 microRNA-21的表达与肿瘤细胞株侵袭转移能力呈正相关。这些发现与既往几个研究相一致 ， 提示 microRNA-21高表达可能与乳腺癌侵袭转移有关。

RECK基因是一个转化抑制基因 ， 通过筛查纤维母细胞cDNAs表达文库被证实 ， 其可将 v-Ki-ras转化的 NIH3T3细胞的圆形形态转变为非转化的扁平形态[13-15]。RECK是一个分子量为 110 kPa的膜嵌合糖蛋白， 位于9p13～p12， 长度 >87 kb， 包含多个表皮生长因子样重复片段和丝氨酸蛋白酶抑制物样的结构域 ， 在结构上与 TIMPs具有同源性[16-18]。RECKmRNA在人类的各种正常组织和未转化细胞中广泛表达 ， 但在癌基因转化细胞中检测不到或下调。经 Pubmed数据库比对 ， RECK部分基因序列与 microRNA-21序列互补结合。在最近的研究中[19， 20]， RECK被报道是 microRNA-21的功能性靶基因 ， 并参与胶质瘤、食管癌的侵袭转移过程。

本文研究结果显示， MCF-7、MDA-231及 MDA-435细胞株中均具有 microRNA-21高表达 ， 且表达量 MDA-435>MDA-231>MCF-7， 其中 ， 具有高侵袭特性的 MDA-435细胞具有最高水平 microRNA-21的表达为 （4.51±0.71）， MDA-231细胞具有中等水平的 microRNA-21表达为 （2.67± 0.27）， MCF-7细胞表达microRNA-21水平相对较低为 （1.23± 0.11）， 比较差异有统计学意义（P

综上所述 ， microRNA-21在乳腺癌细胞中表达增高并与肿瘤侵袭转移有关 ， RNA干扰 microRNA-21的表达可以抑制乳腺癌细胞的侵袭。这些作用可能部分通过 microRNA-21靶向调控RECK而产生。

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[收稿日期：2016-02-16]