HCV NS5A抑制hepcidin蛋白表达的研究

【摘要】目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A（HCV NS5A）对hepcidin基因表达的影响。方法用含HCV NS5A基因的表达质粒pcNS5A稳定转染QC细胞，采用间接免疫荧光技术检测HCVNS5A蛋白的表达。采用逆转录聚合酶链反应观察HCVNS5A mRNA对hepcidin基因表达的影响。蛋白印迹试验观察HCVNS5A 对细胞中hepcidin（c-hepcidin）和培养液中hepcidin（s-hepcidin）蛋白表达的影响。结果转染pN质粒细胞内有HCV NS5A蛋白的表达。未转染组和转染空白质粒pC组细胞内没有HCVNS5A蛋白的表达。转染pN组hepcidin mRNA表达低于转染pC和未转染组，且稳定转染组较瞬时转染组hepcidin mRNA的表达下降更明显，而转染pC和未转染组hepcidin mRNA表达相似。HCVNS5A表达质粒pN转染QC细胞后c-hepcidin和s-hepcidin 蛋白表达下降，且随着转染pN质粒剂量的增加呈进一步下降，且s-hepcidin下降更明显。结论HCVNS5A抑制hepcidin mRNA和蛋白的表达。

【关键词】HCV NS5A；hepcidin

Hepcidin是近期发现的一种由肝脏分泌的小分子抗菌肽，并可通过调节铁的吸收和利用而维持机体铁稳态的平衡，是调节机体铁稳态过程中起核心作用的铁调节激素。HCVNS5A是功能非常活跃的HCV非结构蛋白，我们通过研究HCVNS5A对hepcidin基因表达的影响及其可能的分子机制，探索HCV引起铁代谢紊乱的机理。

1材料与方法

1.1材料①细胞：QSG7701细胞株（以下简称QC）为正常肝脏上皮细胞株。②质粒：pcNS5A（以下简称pN）为1b型HCVNS5A区cDNA克隆至pRc/CMV质粒（以下简称平pC）的BamHI和HindIII位点的重组质粒[1]。

1.2方法通过质粒转染并通过G418筛选出稳定转染的细胞株，并将筛选出的单克隆细胞株进行扩增，并检测HCV NS5A蛋白及基因的表达，通过蛋白印迹法检测细胞株内hepcidin（c-hepcidin）和培养液内（s-hepcidin）蛋白表达。

2结果

2.1转染pN QC稳定细胞株的建立及鉴定

2.1.1转染pN QC细胞株经G418筛选4周抗性克隆形成见图1。

2.1.2转染pN QC稳定细胞株中HCVNS5A的表达见图2。

2.2HCVNS5A 抑制Hepcidin mRNA表达采用RT-PCR方法检测空白组、瞬时转染pC 空质粒组、瞬时转染pN质粒组、稳定转染pC 空质粒组、瞬时转染pN组的QC细胞株hepcidin mRNA的表达，发现转染pN的QC细胞hepcidin mRNA表达下降，且稳定株下降更明显，见图3。

2.3HCVNS5A 抑制hepcidin蛋白的表达采用蛋白印迹试验检测空白组、转染pC 质粒1.0ug组、转染pC 质粒2.0ug组、转染pN 质粒1.0ug组、转染pN质粒2.0ug组的QC细胞内hepcidin（c-hepcidin）和培养液中hepcidin（s-hepcidin）的表达，发现HCVNS5A表达质粒pN转染QC细胞后hepcidin 蛋白表达下降，且随着转染pN质粒剂量的增加hepcidin 蛋白亦进一步减少，s-hepcidin受到的影像更加明显，见图4。

3讨论

Hepcidin是一种肝脏特异性的表达蛋白。hepcidin 基因序列和结构在各物种间高度保守。影响hepcidin表达的因素很多也很复杂。Nishina[2]等人利用HCV感染的转基因小鼠模型研究确定hepcidin的启动子受HCV蛋白的影响。HCVNS5A是HCV功能最活跃的非结构蛋白，为了进一步探寻HCV对hepcidin调控的机制，我们采用逆转录聚合酶链式反应方法研究，发现HCVNS5A可以抑制hepcidin mRNA的表达。同时我们也发现在转染后的细胞培养液中s-hepcidin含量减少更加明显，因此我们推测HCV病毒感染的肝细胞合成分泌hepcidin减少后，其通过旁分泌作用调节非感染肝细胞抵抗HCV病毒能力也受到明显影响。

参考文献

[1]Gong G，Waris G，Tanveer R，et al.Human hepatitis C virus NS5A pro-tein alters intracellular calcium levels，induces oxidative stress，and ac-tivates STAT-3and NF-kappa B.PNAS，2001，98（17）：9599-9604.

[2]Nishina S，Hino K，Korenaga M，et al.Hepatitis C virus-induced reactive oxygen species raise hepatic iron level in mice by reducing hepcidin transcription.Gastroenterology，2008，134：226-238.