CAR-T免疫疗法:肿瘤靶向治疗的新策略

摘 要 嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）细胞是一种全新的治疗恶性肿瘤的策略，它有别于传统的手术、放疗、化疗、抗体药物治疗。CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗中有显著疗效。 本文将综述CAR-T的结构和抗肿瘤的原理、CAR-T细胞在临床上的应用以及CAR-T细胞治疗所面临的挑战及广阔前景。

关键词 嵌合型抗原受体 免疫治疗 肿瘤

中图分类号：R730.51 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）03-0024-04

Chimeric antigen receptor T cell therapy： a new therapeutic strategy for cancer

LI Mengjie*， ZOU Qiuling， DANG Wei

[Sunshine Guojian Pharmaceutical （Shanghai） Co. Ltd.， Shanghai 201203， China]

ABSTRACT Chimeric antigen receptor T-Cell （CAR-T） is a new approach for the treatment of malignant neoplasms and even advanced malignancies. CAR-T cell therapy is different from traditional operation， radiotherapy， chemotherapy and monoclonal antibody drugs. CAR-T cell therapy has showed a significant effect in the treatment of patients with hematologic malignancies. This article reviews the structure of the principles of antitumor of CAR-T and its application， challenges and broad prospects in clinic.

KEy WORDS chimeric antigen receptor； immunotherapy； tumor

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）是由抗体源性靶向区和T 细胞信号区融合而成。表达CAR后的T细胞可以识别、结合特定的肿瘤细胞表面抗原，分泌细胞因子，杀伤肿瘤细胞。CAR-T细胞治疗作为一种全新的治疗方式，被2013年《科学》杂志评为全球十大科技创新之首。CAR-T在血液肿瘤的治疗中已经取得显著疗效，但是在实体瘤的治疗中仍存在很大的困难和挑穑需要更多的探索和突破。目前国内外已有上百个CAR-T的临床实验在开展。本综述将阐述CAR-T的结构和抗肿瘤的原理、CAR-T细胞在临床上的应用以及CAR-T细胞治疗所面临的挑战及广阔前景。

1 CAR-T的结构和原理

CAR-T细胞即嵌合抗原受体T细胞。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区（通常来源于抗体抗原结合区域的scFv段）、一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号区[1]。一旦T细胞表达这种受体，单个融合分子便与抗原进行特异性结合并激活T细胞，因此经嵌合抗原受体修饰的T细胞具有抗体的特异性和效应T细胞的细胞毒作用。CAR一旦与肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）结合，可通过由CD3或高亲和性受体FceRI的胞内区使T细胞活化，表现为CAR依赖的细胞杀伤、增殖及细胞因子释放[2]。同时CAR-T细胞的扩增倍数可超过1 000倍， 临床实验中发现输入CAR-T细胞六个月后患者体内仍能检测到高水平表达的CAR[3]。总而言之，CAR-T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高。

20世纪80年代晚期，以色列科学家Eshhar等[4]开发了第一种CAR-T细胞，即第一代CAR。第一代CAR-T细胞只在T细胞表面表达一个单链抗体基因，这个单链抗体表达后可以特异性识别肿瘤细胞表面的分子。第一代CAR很快投入临床试验，令人遗憾的是，第一代CAR虽然具有特异性的细胞毒性，但没有表现出显著的疗效。究其原因是因为第一代CAR-T细胞在患者体内持久性差，很快就会耗竭，CAR-T细胞还未接触到大量的肿瘤细胞就已经凋亡了[5-6]。为了加强CAR激活信号并突破第一代CAR的限制，结合了共刺激结构的第二代CAR相继被报道，第二代CAR的组成结构中添加了T细胞完全活化和生存必须的第二信号分子（比如CD28或者4-1BB分子）[7-8]。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28提供了T细胞激活的第二刺激信号，CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌。许多研究都表明[9-10]，搭载了“共刺激信号分子”的第二代CAR与第一代CAR相比，抗原特异性不变，T细胞增殖、细胞因子分泌增加，抗细胞凋亡蛋白分泌增加，细胞死亡延迟。之后有研究人员将CD28用CD137（4-1BB）进行替换，使用CD28还是4-1BB，不同的第二代CAR究竟孰优孰劣，不同的研究者用不同的肿瘤在体内和体外的研究中得到的结果不尽相同[5， 11-12]。最近有研究表明4-1BB分子使得CAR-T细胞具有更高的稳定性，减缓了CAR-T细胞在体内的耗竭[13]。总而言之，第二代CAR在随后的临床试验中产生了显著的疗效，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia ，ALL）患者，其完全缓解率高达90%以上。然而在缺乏外源共刺激分子的情况下所有二代CAR均不能产生足够的IL-2促进T细胞增殖，当给予外源性B7共刺激分子时这些转基因CAR-T细胞则可产生IL-2促进其增殖[14-15]。随后，为了进一步增强CAR-T细胞在体内的存活，研究人员开发了第三代CAR，就是在第二代CAR的基础上再增加一个第二信号分子，比如将CD28和4-1BB分子同时组装进CAR里面[16]。目前第二代和第三代的设计都各自已有临床试验的应用，临床试验的数据仍需持续关注[17-19]。最新改良设计的第四代CAR-T表现出了克服免疫抑制微环境的能力，有望成为实体肿瘤治疗中的重要手段[20-21]：第四代CAR-T是在第二/第三代CAR-T的基础上表达一些关键的细胞因子，例如IL-12。IL-12被誉为T淋巴细胞的第三信号分子，可见其对T细胞功能的重要性。全身注射IL-12患者会引起严重的炎症副反应，但是通过CAR-T细胞来实现局部表达后，可以在肿瘤病灶处招募NK细胞，或者直接逆转被耗竭的肿瘤浸润性T淋巴细胞，从而有效克服肿瘤免疫抑制微环境[22]。

2 CAR-T细胞的临床应用

CAR-T细胞治疗的整个过程如下[5]：首先从患者血液中分离得到的白细胞通过流式或者磁珠分选得到CD4+和CD8+ T细胞，T细胞再使用微球或者人工抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC）进行激活和扩增，然后再采用不同的方式（慢病毒、逆转录病毒、转座子和RNA）将改造好的CARs转入T细胞，经过改造的T细胞进行质量控制后再重新回输入患者体内以发挥疗效。

目前CAR-T细胞治疗的临床实验主要集中在恶性血液病中。其中研究最多的是CD19这个靶标，CD19特异性表达于恶性和正常B细胞以及B细胞前体细胞，而造血干细胞及非造血细胞则不存在CD19表达[23]。许多临床数据显示CART19针对B-ALL的应答率均高于80%[24-26]。尽管进一步的研究仍在继续，但是CAR-T细胞至少在1例患者体内存在超过10年之久[27]，这也预示着CAR-T细胞可能就是一种“活着的药物”。同时临床试验也发现CD19基因表达下调或者基因突变会导致B-ALL的复发率提高[28-29]。因此其他靶点（CD20，CD22）[19， 30]的临床试验也在开展中。同时靶向两个目标分子的双靶标CAR-T治疗可能会改善这种逃逸。

对于非B细胞性恶性血液肿瘤（例如多发性骨髓瘤）也有一些新的靶点分子应用于CAR-T治疗。B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）在多发性骨髓瘤细胞中高表达，BCMA-CART细胞在异种移植模型中可以杀死人的多发性骨髓瘤细胞[31]，相应的一期临床试验正在进行。恶性髓系血液病的治疗在过去几十年均未取得很大的进展，可能CAR-T治疗方法将改善这种现状。基于CD33、CD123靶点的CAR-T治疗也已在一期临床试验中[32-33]。但是由于CD33、CD123在正常的血液干细胞中也表达，有研究者提出可以将CAR-T治疗和骨髓移植手术结合使用[34]。众所周知CAR-T治疗在实体瘤中遇到了很大的挑战。这主要源于实体瘤在漫长的形成过程中，在肿瘤细胞周围营造了一个免疫抑制的微环境；另外大部分针对实体瘤的靶点分子在正常组织中也有表达。目前开展的针对实体瘤的CAR-T临床试验主要集中在以下几个靶点：靶向HER-2治疗HER-2过表达的实体瘤[35]；靶向GD-2治疗成神经细胞瘤和黑色素瘤（NCT01822652和NCT02107963）；靶向EGFRvⅢ以治疗成胶质细胞瘤[36-37]。其他的TAA主要还有Mesothelin、PSMA、GPC3、MET、CEA、MUC1和MUC16等[18]，因此CAR-T细胞疗法在抗肿瘤方面已开展了广泛的应用。

CAR-T细胞疗法给肿瘤治疗带来了新希望，但是临床试验中所产生的不良反应也越来越引起研究者的重视。细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T 细胞治疗常见且致死性的并发症。CRS的发生率和严重程度因CAR-T细胞输入而不同，这与CAR结构、患者的肿瘤负荷及类型等多因素相关[38]。目前仍不清楚是否CRS是达到最好疗效所必须的，一般认为部分的CRS毒性是需要的。因此如何平衡CAR-T细胞治疗和有效性和安全性需要更多的临床试验数据给予更好的解答。CRS经常伴随着高水平IL-6的分泌，应用IL-6受体拮抗剂（tocilizumab）可明显改善CAR-T治疗后的严重CRS问题[39]，因此在CAR-T细胞治疗过程中及时恰当控制CRS是非常重要的。B细胞发育不全可以注射丙球蛋白作为补充治疗，CAR-T细胞在体内消失后B细胞可以恢复。而对于CRA-T治疗后的神经毒性，除癫痫需要接受抗癫痫药物治疗外，其他大部分神经症状是可逆的。随着更多的患者接受CAR-T细胞治疗，临床研究已经重视毒性反应及其处理办法的研究，包括减少CAR-T细胞的输入剂量、细胞因子封锁、类固醇以及补充免疫蛋白的最佳给药时间和剂量[40]。

3 CAR-T细胞疗法的现状和发展前景

CAR-T细胞治疗技术在各种细胞治疗策略中表现出了最具前景的发展态势。但实际上，CAR-T细胞治疗也面临不少挑战。例如：①CAR-T细胞治疗技术实质上是一种靶点依赖型的治疗，良好的治疗靶点比较少；②某些肿瘤相关抗原在正常细胞有低水平表达，导致CAR-T治疗可能会产生脱靶毒性，引发严重的副反应；③CAR-T细胞在实体瘤治疗中的瓶颈；④部分患者本身T细胞功能低下甚至无法体外扩增；⑤基于病毒表达体系的CAR-T技术的生物安全性值得重视。针对这些问题科学家们也在不断地探索中。对于CAR-T临床应用的安全性，目前的主要策略是改用非病毒载体改造CAR-T，及通过自杀基因控制CAR-T细胞的过度扩增及降低严重不良反应[41]。非病毒基因转染方式包括“睡美人（sleeping beauty，SB）”转座子系统和mRNA转染[42-43]。在治疗实体瘤方面，临床前的研究显示第四代CAR-T具有更好的抗肿瘤免疫抑制微环境的能力和肿瘤杀伤能力，有望在血液肿瘤和实体肿瘤中发挥更大作用[22]。还有一些研究发现[44]，在CAR-T细胞中共表达趋化因子CCR2b，也可以增强CAR-T细胞的归巢能力。应用间皮素特异性mRNA-CAR-T细胞治疗间皮素高表达的晚期实体瘤取得了较好的临床疗效，这也为CAR-T细胞针对实体瘤的治疗设计提供了新的策略。目前的细胞疗法都是个体化的，需要使用患者自体的T细胞进行体外转化和培养，不利于实现大规模量产。法国Cellectis公司开发通用型CAR-T，即用正常第三方细胞来源的T细胞，通过敲除内源性TCR基因以排除同种异体TCR导致的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD），且能M一步提高CAR-T的杀肿瘤效率。这种策略显著拓宽了CAR-T的细胞来源，使得CAR-T细胞疗法更具商业化前景。

4 Y语

2012 年一名叫 Emily 的化疗不敏感白血病小患者接受了CAR-T治疗后，到今年已经第 4年无癌生存。CAR-T 技术为肿瘤治疗开启了新的篇章，众多的科学家仍在积极探索研究中，多家大型制药企业也在关注和投资。目前主要竞争者为诺华、朱诺治疗公司以及美国凯特公司。CAR-T细胞治疗有望在明年获得上市批准，造福更多的患者。优化 CAR-T的结构，设计出性能高，又安全的 CAR-T 以及CAR-T细胞的大规模生产是当前所面临的技术难关。今后 CAR-T细胞治疗新策略在于：①多靶标的CAR-T，临床前实验显示出更强的抗瘤效应；②CAR-T细胞治疗技术仍需与其他治疗手段相配合来达到最佳治疗效果；③异体CAR-T细胞的开发；④CAR-T治疗和免疫检查点的单克隆抗体（例如PD-1，PD-L1）的联合使用。随着技术的不断改良优化，临床经验的积累，多方面资源的整合，我们期待它将会为肿瘤患者们带来更多的惊喜。

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