转基因植物标记基因安全性研究进展

摘要 对目前提高转基因植物标记基因安全性的方法进行综述，包括共转化法、转座子法、位点特异性重组系统、同源重组以及利用无选择标记基因的转化系统及安全标记基因的转化系统。介绍了上述各方法的原理、优缺点及其在转基因植物中的研究进展，并对其未来的发展趋势进行了展望。

关键词 转基因植物；标记基因；安全性；提高方法

中图分类号 Q788 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）03-0017-04

Research Progress on Selection Marker Genes in Transgenic Plant

SUN Yan 1，2 DAI Shao-jun 1 WEI Jian-hua 2 WANG Hong-zhi 2 *

（1 Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University，Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field，Ministry of Education，Harbin Heilongjiang 150040； 2 Beijing Agricultural Biotechnology Research Center）

Abstract Techniques developed in recent years to improve security in using marker genes in transgenic plants were reviewed，including co-transformation，transposition，site - specific recombination，homologous recombination，non-selective marker gene transformation system and biosafety marker genes transformation system.The principles，the merits，shortcomings of different approaches and the research achievements in transgenic plants were introduced，and a prospect of their development was proposed.

Key words transgenic plant；selection marker gene；safety；Promote method

随着植物细胞全能性的发现和转基因技术的发展，人类已经利用基因工程改变植物的性状，在提高作物产量、改善品质、解决全球不断增长的粮食需求等方面发挥了重要作用。但随着转基因技术的迅猛发展，在关注转基因植物所带来的巨大经济效益的同时，其安全性问题也日益受到人们的重视。

植物转基因操作中，通常用标记基因将转化细胞筛选出来。在选择压力下，非转化细胞不具备抗性而死亡，因此在转基因研究中，抗性标记基因对于从大量非转化细胞中选择转化细胞至关重要。目前，转基因研究中普遍应用的抗性标记基因是抗生素和除草剂抗性基因。这些抗性标记基因在植物转化过程中是很有利的选择工具。然而，一旦转化完成，这些抗性基因便失去了作用，其存在还可能带来生物安全性问题[1]。另外，由于选择标记基因数量有限，这些基因的存在也给转基因植物的再次转化带来了不便[2]。

对转基因植物中标记基因的安全性评价主要集中在环境和食品安全性2个方面，其中对环境危害评价已发展到从分子、个体、种群、群落到生态系统的水平。标记基因的环境安全性主要包括：转基因植物的残枝落叶转移到其他土壤微生物中从而导致外源抗性基因的逃逸，可能造成生态失衡；很多情况下标记基因的沉默可能引起邻近目的基因的沉默。转基因产品中的抗生素抗性基因，有可能通过食物链，最终给人类的安全带来潜在的威胁[3]。在解决转基因植物可能存在的安全性问题中，研究者研究了共转化法、转座子法、位点特异性重组系统、同源重组[4]、无选择标记基因的转化系统[5]及安全标记基因的转化系统等方法。现对提高转基因植物标记基因安全性的方法作一综述。

1 共转化法

共转化的原理是将目的基因和标记基因单独组装到2个质粒上，或1个质粒的2个不同T-DNA区段上，然后同时转化。由于T-DNA的插入是随机的，二者可同时插入同一细胞的不同染色体上，经过后代的遗传重组，使目的基因与标记基因分离，从而获得仅带有目的基因的转基因植株[6]（图1）。

Komari et al[7]构建了包含2个T-DNA的超二元质粒载体，将gus（β-glucuronidase）和hpt（hygromycin phosphotran sferase）通过共转化方法转入烟草和水稻，经过后代分离，50％以上的株系为无标记基因的gus转基因植株。Miller et al[8]通过多个菌株共转化玉米，共转化率为11.7%；而通过包含双T-DNA超二元质粒载体进行转化，共转化率高达93.4%。陈松彪等[9]采用体外重组技术构建一个双T-DNA载体系统，41.7％的后代为无选择标记的转基因烟草植株。为了提高共转化效率，研究者们对共转化方法进行了改进。叶兴国等[10]通过几个中间质粒构建了含有3段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1，高频率获得无选择标记转基因大豆植株。

共转化系统去除转基因植物中选择标记为最早研究的技术，因其方法简单，多数无选择标记转基因作物均通过共转化系统所获得。目前，国内外已成功地运用共转化法获得了烟草、水稻、玉米和大豆等[7-10]作物的无选择标记转基因植株。但是共转化需要有性杂交过程将标记基因和目标基因分离，限制了此种方法在无性繁殖植物中的应用。此外，共转化耗时长，工作量大且转化效率较低，极大地限制了共转化系统的应用。

2 转座子法

转座子是存在于染色体DNA上的一段可自我复制和移动的DNA序列。把标记基因或目的基因和转座子相连，在转座子移动的过程中，标记基因与目的基因分离，子代植株通过遗传分离，获得仅带目的基因的转基因植株。因此，转座子系统可用于培育无选择标记的转基因植株。目前，已经报道的用于转基因植物标记基因删除的转座系统来源于玉米的Ac/Ds系统。

Goldsbrough et al[11]以nptⅡ（neomycin phosphotransferase Ⅱ）为选择标记基因，以gus为报告基因转化番茄，在转基因植株后代中发现nptⅡ和Ds-gus-Ds结构的重组分离现象，获得了只含gus基因而无选择标记基因nptⅡ的转基因植株。Ebinuma et al[12]将ipt（isopentenyltransferase）基因插入Ac基因中，然后与nptⅡ和gus基因串联构建成MAT（Multi-Auto-Transformation）表达载体，用其转化烟草和白杨，在转基因植株后代中发现无标记基因的转基因植株。

转座子具有跳跃性和可删除性，不需要再次转化或杂交引入重组酶。但是该途径也存在一些问题，如效率较低、需要有性繁殖分离途径、周期较长等，仅适用于有性繁殖以及生活周期短的植物，限制了其在标记基因剔除中的应用。

3 位点特异重组系统

位点特异性重组系统包括2个基本元件，即重组酶基因和特异性识别位点。把标记基因放在2个识别位点之间，在重组酶的作用下，标记基因可以被切除[13]（图2）。

目前，在植物中已发现的有效的位点特异性重组系统有来源于噬菌体Pl的Cre/loxP（Cre：causes recombination；LoxP：locus of crossing X-over in P1）系统、接合酵母SR质粒的R/RS （R：recombinatinase；RS：recombination site）系统、啤酒酵母的2 μm质粒FLP/FRT（FLP：flipping DNA；FRT：FLP recombination target）系统和噬菌体Mu的Gin/Gix（Gin：inver-tion of the G loop；Gix：Gin invertion complex sites）系统，其中以Cre/loxP系统的应用最为广泛。

3.1 Cre/loxP系统

Cre/loxP系统去除筛选标记的原理是将标记基因构建于lox系统的2个34 bp特异识别序列之间，将目的基因构建于lox位点之外，筛选到转化子后再诱导Cre酶表达，从而切除选择标记基因。

Dale et al[14]首次利用此方法转化烟草，将一个嵌合的荧光素酶（Luc）基因作为报告基因插入到含有选择标记基因hpt的载体中，Cre重组酶的表达催化2个同向lox位点间的重组反应，使hpt基因被切除，切除效率达到90.9%。一些研究者采用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达，在适当的时候对转基因植株进行化学诱导或热激处理来删除标记基因。此系统通过一次转化即可获得无选择标记的转基因植株。Zuo et al [15]构建了一个化学诱导型的载体转化拟南芥，以受雌二醇诱导的融合转录激活因子XVE控制Cre基因的表达，从而剔除lox序列之间的选择标记基因，获得了高频率的无选择标记的转基因拟南芥。Luo et al[16]利用同向融合loxP与FRT 2个特异识别位点构建识别位点loxP-FRT，获得一个全新的基因删除系统，大大提高了外源基因的删除效率。宋洪元等[17]利用Cre/lox定位重组系统在烟草中成功实现了与gfp（green fluorescent protein）基因连锁的bar（bial-aphos resistance）基因的高效删除，并通过自交分离的办法获得了含gfp的无选择标记转基因烟草，表明利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的。Zhang et al[18]在位点特异重组系统Cre/lox中引入雌二醇诱导表达系统，成功获得了无选择标记基因的抗逆番茄。Khattri et al [19]利用Cre/lox系统转化水稻，由大豆热激启动子控制Cre重组酶基因的表达，获得了无选择标记基因的转基因水稻。由于化学诱导和热激诱导都需要对转基因植株进行处理，这可能对转基因植株的生长产生不利的影响。利用组织特异性启动子调控表达Cre基因来删除标记基因，不需要任何诱导剂即可完成标记基因的组织特异性删除。Kopertekh et al[20]将2个载体pLH-nap-vst-lx-35S-bar-lx和pLH-gus-nap-cre共转化烟草。Cre重组酶基因由种子特异性启动子napin控制，在种子异表达并删除bar基因。结果表明T1代种子中bar基因已被高效删除。通过反相高效液相色谱证明了此系统不会对靶基因的表达产生影响。

3.2 FLP/FRT系统

FLP/FRT系统中FLP重组酶可催化位于同一DNA分子上2个同向位点FRT间DN段的切除，可用于选择标记基因的删除。目前，已成功获得无选择标记基因的烟草、玉米、水稻等[21-25]作物。

Woo et al[24]采用氧化胁迫诱导的过氧化物酶（POD）启动子控制重组酶FLP基因的表达，将转基因烟草用过氧化氢处理，13%~41%的再生植株的标记基因被删除。Li et al[25]将表达FLP重组酶基因的转基因玉米与包含靶基因AtNHX1（提高植物耐盐性）和位于FRT 2个识别位点之间的选择标记基因als（acetolactate synthase）的转基因玉米进行杂交，在F1代植株中，40.7%的als基因被删除。进一步盐胁迫试验表明，在高盐环境下，无选择标记的AtNHX1转基因玉米的产量高于野生型。

3.3 Gin/gix系统

Maeser et al[26]发现Gin/gix系统，重组酶Gin表达时可催化同一DNA分子上2个特异位点gix间DN段的切除，但因Gin基因影响植物的再生，该系统在植物中成功应用尚未见报道。

3.4 R/RS系统

R/RS系统中重组酶R能够专一地识别其特有的识别序列RS，并将2个紧邻的RS之间的DN段切除。

Onouchi et al[27]将含有RS-gus -RS的转基因拟南芥与由35S启动子控制的R基因的转基因拟南芥进行有性杂交，借助杂合状态下R基因的表达，删除了转RS-gus-RS基因拟南芥中的gus基因。Sugita et al [28]利用R/RS系统建立了GST-MAT载体，将重组酶R与化学诱导表达的启动子GST-Ⅱ-27（glutathione-S-transferase，谷胱甘肽转移酶）融合，这样在转化当代就获得了无选择标记的转基因烟草。Saelim et al[29]利用该系统对木薯进行转化，表型正常的转化植株中有88%~96%为无选择标记转基因木薯。Khan et al[30]利用该系统获得了无ipt选择标记基因的转基因番茄。位点特异性重组是目前无选择标记转基因植物研究中广泛应用的方法。尤其是后来发展起来的化学诱导系统，通过化学诱导表达的启动子驱动重组酶基因表达，从而严格控制标记基因删除。此外，此技术在标记基因删除过程中不需要二次转化，适合于无性繁殖的植物。同时它也存在弊端，利用位点特异重组酶切除标记基因时，往往在重组位点留下一个识别序列，从而影响同一位点特异性重组系统在受体植物中的再次应用。另外，经过几次去除标记基因后，基因组中分布着多拷贝的识别序列，可能会导致目的基因沉默。

4 同源重组

同源重组发生在DNA的同源序列之间，重组以后会导致位于同源序列之间的基因序列的切除。把标记基因放在2个DNA同源序列之间，发生同源重组后，标记基因可以被切除，即可获得无标记基因的转基因植株。

Fischer et al[31]利用同源重组的原理，在标记基因aadA（aminoglycoside-3′-adenyltransferase）两端加上正向重复序列，转入烟草叶绿体基因组，在有选择压力条件下得到转化植株，当去掉选择压力后发现aadA基因由于同源重组而被去除。噬菌体的352 bp的附属P区域attP（attachment site phage）是3个特异蛋白的结合位点，在烟草中，attP区不需要特异蛋白辅助就能切除位于2段attP重复序列之间的DNA序列。Zubko et al[32]利用attp同源序列介导的染色体内同源重组剔除了选择标记基因，得到了无标记基因的转基因烟草。

同源重组对序列特异性没有要求，严格地配对即可，其机理与位点特异性重组相同，但无需辅助蛋白参与，因而也不会对植物基因组造成可能的伤害。但是由于重组频率低，限制了其广泛应用。目前，此技术已成功应用于微生物和动物，但在植物中的应用尚处于探索阶段。

5 无选择标记基因的转化系统

在植物遗传转化过程中，可以不使用选择标记基因就能获得含目的基因的转基因植株，如马铃薯[33]、烟草[34]等。Li et al[35]通过根癌农杆菌介导转化烟草，在不使用选择压力的情况下获得了无选择标记的转基因烟草，转化率为4%。Madhurima et al[36]报道了一个不使用任何选择标记基因的方法转化花生。他们利用根癌农杆菌介导转化花生的子叶外植体，转化率高达75%。无选择标记基因的转化系统简单、高效，为培育无选择标记转基因植株提供了新的方法。但是此方法也存在弊端，由于无法对转化植株的生长进行选择性地控制，研究者们必须从大量的再生植株中检测出转基因植株，这样不仅花费高而且还很耗时[37]。

6 安全标记基因的转化系统

安全标记基因是对生态环境和人体健康相对安全的标记基因。使用这类基因作选择标记的转化选择系统不是将非转化细胞杀死，而是使转化细胞处于某个有利的代谢或发育条件下，从而筛选出转化植株[38]。

近年来发现的生物安全标记基因主要有木糖异构酶基因（xylose isomerase，xylA）、6-磷酸甘露糖异构酶基因（6-phosphomannose isomerase，pmi）、异戊烯基转移酶基因（iso-pentenyl transferase，ipt）、吲哚-3-乙酰胺水解酶基因（indole-3-acetamide hydrolyse，iaaH）、甜菜碱醛脱氢酶基因（betain-ealdehydedehydrogenase，BADH）、β-葡萄糖醛酸苷酶基因（β-glucuronidase，gus）、绿色荧光蛋白基因（green fluor-escent protein，gfp）等。目前，生物安全标记基因已成功用于水稻、玉米、小麦、大麦等[39-42]的遗传转化。

安全标记基因本身及表达产物一般没有毒性，选择剂也无毒副作用，转化效率高，因此安全标记基因的筛选系统在提高转基因植物安全性研究中发挥了重大作用。然而，标记基因的存在不利于多重转化，无法将多个优良性状累积在同一转化植株内；而标记基因删除技术为此提供了一个很好的解决方案，能够彻底地删除转基因植物中的标记基因，从根本上解决转基因植物安全性问题。

7 展望

当前转基因植物的安全性倍受世人关注，无选择标记转基因技术为此做出了巨大贡献，避免了标记基因可能造成的环境、生态及食品的安全隐患。但其难免存在不足，需要深入研究。相信随着科学技术的发展，无选择标记转基因技术的不断完善，转基因植物的安全性问题将能够彻底解决，人们对转基因技术的质疑也将逐渐消失，使转基因植物的应用更加广泛，从而为人们带来巨大的经济效益和社会效益。

8 参考文献

[1] DARBANI B，EIMANIFAR A，STEWART CN ，et al. Methods to produce marker-free transgenic plants[J]. Biotechnol J，2007（2）：83-90.

[2] KERRY A L，MALIGA P.Construction of marker-free transplastomic plants[J]. Curr Opi Biotechnol，2007（18）：1-8.

[3] DALE P J，CLARKE B，FONTES E M G.Potential for the environmental impact of transgenic crops[J].Nature Biotechnology，2002（20）：567-574.

[4] YODER J I，GOLDSBROUGH A P.Transformation systems for generating marker-free transgenic plant[J].Biotechnology，1994（12）：263-267.

[5] PRAKASH C，AKULA，ANAND M，et al. An update on the progress towards the development of marker-free transgenic plants[J].Botanical Studies，2010（51）：277-292.

[6] EBINUMA H，SUGITA K，MATSUNAGA E，et al.Systems for the removal of a selection marker and their combination with a positive marker[J]. Plant Cell Rep，2001（20）：383-392.

[7] KOMARI T，HIEI Y，SAITO Y，et al.Vectors carrying two separate T-DNA for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers[J]. Plant J，1996（10）：165-174.

[8] MILLER M，TAGLIANI L，WANG N，et al.High efficiency transgene segregation in co-transformed maize plants using an Agrobacterium tumefaciens 2 T-DNA binary system[J].Transgenic Res，2002（11）：381-396.

[9] 陈松彪，李旭刚，王锋，等.无选择标记转基因植物的培育[J].中国生物工程杂志，2005（25）：1-7.

[10] 叶兴国，秦华.通过构建三段T-DNA载体高频率获得无标记转基因大豆植株的研究[J].生物工程学报，2007（23）：138-144.

[11] GOLDSBROUGH A P，LASTRELLA C N，YODER J I.Transposition me diated re-positioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato[J].Biotechnology，1993（11）：1286-1292.

[12] EBINUMA H，SUGITA K，MATSUNAGA E，et al. Selection of Marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997（94）：2117-2121.

[13] WANG Y，YAU Y，PERKINS-BALDING D，et al. Recombinase technol ogy：applications and possibilities[J]. Plant Cell Rep，2011（30）：267-285.

[14] DALE E C，OW D W. Gene transfer and subsequent removal of the selec tion gene from the host genome[J].Proc Natl Acad Sci USA，1991（88）：10558-10562.

[15] ZUO J，NIU Q W，MOLLER S G，et al.Chemical-regulated，site-spe cific DNA excision in transgenic plants[J].Nature Biotechnology，2001（19）：157-161.

[16] LUO K，DUAN H，ZHAO D，et al.GM-gene-deletor：fused loxP- FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants[J]. Plant Biotechnology Journal，2007（5）：263-274.

[17] 宋洪元，任雪松，司军，等.利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草[J].中国农业科学，2008（41）：2973-2982.

[18] ZHANG Y，LIU H，LI B，et al. Generation of selectable marker-free tran sgenic tomato resistant to drought，cold and oxidative stress using the Cre/loxP DNA excision system[J].Transgenic Res，2009（18）：607-619.

[19] KHATTRI A，NANDY S，SRIVASTAVA V. Heat-inducible Cre-lox sys tem for marker excision in transgenic rice[J]. J Biosci，2011（36）：37-42.

[20] KOPERTEKH L，SCHULZE K，FROLOV A，et al.Cre-mediated seed-specific transgene excision in tobacco[J].Plant Mol Biol，2010（72）：597-605.

[21] LYZNIK L A，MITCHELL J C，HIRAYAMA L，et al. Activity of yeast FLP recombinase in maize and rice protoplasts[J]. Nucleic Acids Resea- rch，1993（21）：969-975.

[22] 罗克明，赵德刚，Li Y，等.一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用[J].高技术通讯，2005（15）：61-66.

[23] 高媛媛，赵德刚，罗克明，等.热诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因[J].高技术通讯，2007（17）：180-184.

[24] WOO H J，CHO H S，LIM S H，et al.Auto-excision of selectable marker genes from transgenic tobacco via a stress inducible FLP/FRT site-specificrecombination system[J].Transgenic Res，2009（18）：455-465.

[25] LI B，LI N，DUAN X，et al.Generation of marker-free transgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRT recombination system[J].Journal of Biotechnology，2010（145）：206-213.

[26] MAESER S，KAHMANN R. The Gin recombinase of phage Mu can cat-alyse site-specific recombination in plant protoplasts[J].Mol Gen Genet，1991（230）：170-176.

[27] ONOUCHI H，NISHIHAMA R，KUDO M，et al.Visualization of site-specific recombination catalyzed by a recombinase from Zygosacchar-omy ces rouxii in Arabidopsis thaliana[J].Mol Gen Genet，1995（247）：653-660.

[28] SUGITA K，KASAHARA T，MASUNAGA E，et al.A transformation vec-tor for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency[J].Plant J，2000（22）：461-469.

[29] SAELIM L，PHANSIRI S，SUKSANGPANOMRUNG M，et al.Evaluation of a morphological marker selection and excision system to generate ma-rker-free transgenic cassava plants[J]. Plant Cell Rep，2009（28）：445-455.

[30] KHAN R，NAKAMURA I，MII M.Development of disease-resistant marker-free tomato by R/RS site-specific recombination[J].Plant Cell Rep，2011（30）：1041-1053.

[31] FISCHER N，STAMPACCHIA O，REDDING K，et a1. Selectable marke r recycling in the chloroplast[J]. Mol Gen Genet，1996（251）：373-380.

[32] ZUBKO E，SCUTT C，MEYER P. Intrachromosomal recombination bet-ween attP regions as a tool to remove selectable marker genes from tobacco transgenes[J].Nature Biotech，2000（18）：442-445.

[33] DE VETTEN N，WOLTERS A M，RAEMAKERS K，et al.A transform-ation method for obtaining marker-free plants of a crosspollinatingand vegetatively propagated crop[J].Nat Biotechnol，2003（21）：439-442.

[34] JIA H G，LIAO M J，VERBELEN J-P，et al.Direct creation of marker-free tobacco plant from agroinfiltrated leaf discs[J].Plant Cell Rep，2007（26）：1961-1965.

[35] LI B，XIE C，QIU H.Production of selectable marker-free transgenic tobacco plants using a non-selection approach：chimerism or escape，transgene inheritance，and efficiency[J].Plant Cell Rep，2009（28）：373-386.

[36] MADHURIMA B，KALYANI P，POOJA B M，et al.An efficient method for the production of marker-free transgenic plants of peanut（Arachis hypogaea L.）[J]. Plant Cell Rep，2010（29）：495-502.

[37] MANIMARAN P，RAMKUMAR G，SAKTHIVEL K，et al. Suitability of non-lethal marker and marker-free systems for development of trans-genic crop plants：Present status and future prospects[J].Biotechnology Advances，2011（29）：703-714.

[38] JOERSBO M. Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes[J]. Physiologia Plantarum，2001（111）：269-272.

[39] CHUNG B C，KIM J K，NAHM B H，et al.In Planta visual monitoring of green fluorescent protein in transgenic rice plants[J].Mol Cells，2000（10）：411-414.

[40] NEGROTTO D，JOLLEY M，BEER S，et al.The use of phosphomannose isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants（Zea mays L.）via Agrobacterium transformation[J].Plant Cell Rep，2000（19）：798-803.

[41] GADALETA A，GIANCASPRO A，BLECHL A，et al.Phosphomannose isomerase，pmi，as a selectable marker gene for durum wheat transforma-tion[J]. Journal of Cereal Science，2006（43）：31-37.

[42] AHLANDSBERG S，SATHISH P，SUN C，et al. Green fluorescent protein as a reporter system in the transformation of barley cultivars[J].Physiolo- gia Plantarum，1999（107）：194-200.